人乳頭瘤病毒高危型的CODEHOP檢測及-16、-18型核酸檢測質(zhì)控物的研究.pdf

1、第一部分人乳頭瘤病毒(HPV)高危型-16，-18核酸檢測質(zhì)控物的研究。 目的:研制得到能模擬真實臨床標本的人乳頭瘤病毒(HPV)高危型16、18核酸檢測質(zhì)控物，并探討其用于臨床實驗室HPV-16、18核酸檢測室間質(zhì)量評價的有效性。 方法:本實驗分為兩大部分，第一部分中，通過PCR方法克隆出HPV-16臨床檢測常用的靶基因片段，利用分子克隆方法構(gòu)建含HPV-16靶基因的真核細胞載體pEGFP-C1-HPV-16質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染

2、已含HPV-18的Hela上皮細胞系，獲得含HPV-16、18核酸的上皮細胞原液，經(jīng)甲醇固定后，檢測其穩(wěn)定性和特異性。第二部分中，將測定好各項指標的細胞原液適當稀釋后，組成含陰陽性的共12份標本的樣本盤，發(fā)至全國各開展臨床HPV-16，-18檢測的實驗室，進行一次全國性的室間質(zhì)量評價，并對回報結(jié)果進行統(tǒng)計處理。 結(jié)果:構(gòu)建了含HPV-16檢測片段的重組真核表達載體，并轉(zhuǎn)入宮頸上皮癌細胞系(Hela)中，得到了可模擬臨床標本的HP

3、V-16，-18 PCR檢測的質(zhì)控物，采用深圳匹基、中山達安HPV PCR商品檢測試劑盒對樣本進行定性和定量檢測。樣本原液經(jīng)1：10、1：50、1：100、1：500稀釋后，實時熒光：PCR檢測HPV-16的C<,T>值分別為29.10、31.19、32.15和32.73，HPV-18的C<,T>值分別為30.32、32.13、32.22和35.55。質(zhì)控物在4℃下可穩(wěn)定40天以上，盲郵至新疆烏魯木齊、內(nèi)蒙古呼和浩特和廈門的樣本，返回后

4、檢測無明顯變化。44個臨床實驗室對濃度大于10<'4>拷貝/ml的樣本的檢測符合率平均為95.13％，對低于10<'3>拷貝/ml的樣本的檢測符合率為57.3％。對陰性樣本符合率為98.3％。 結(jié)論:成功地得到了可模擬臨床標本的HPV-16，18核酸檢測質(zhì)控物，可有效地用于臨床實驗室室間質(zhì)評，質(zhì)評結(jié)果表明，臨床實驗室仍有待于提高HPV-16，18檢測的靈敏度。 第二部分人乳頭瘤病毒(HPV)高危型CODEHOP檢測方法的

5、研究。 目的:利用一致-簡并雜交寡核菅酸引物(consensus-degenerate hybridoligonucleotide primer，CODEHOP)這種新的引物設(shè)計方法檢測HPV高危型，并探討其用于臨床實驗室HPV高危型核酸檢測有效性。 方法：通過GenBank databases或EMBL databases得到HPV高危型各亞型L1基因序列和低危型各亞型將不同的L1基因序列輸入Block Maker程序

6、獲得氨基保守的氨基酸模塊(block)，將這些保守的模塊進行對比，挑選出E區(qū)間和J區(qū)間這兩個與低危型不同區(qū)間設(shè)計引物，將這些保守的模塊輸入到blocks網(wǎng)站上的CODEHOP程序上，獲得一系列引物，根據(jù)簡并度，退火溫度，等一系列條件，挑選出合適的雜交引物對，將得到的雜交引物進行篩選通過嘗試性PCR擴增優(yōu)化反應(yīng)條件，利用篩選的引物和優(yōu)化過的反應(yīng)條件對已知的質(zhì)粒樣本進行擴增，檢驗其特異性和靈敏性，并對陽性的臨床樣本進行擴增，檢驗其在臨床上的

7、實用性。 結(jié)果:合成針對HPV高危型的CODEHOP雜交引物，利用該引物對己知的質(zhì)粒樣本進行擴增，得到理想條帶。檢測出HPV-45，-51，-16，-18等多種高危型。由于時間限制，只對59份未分型臨床樣本進行了檢測，陽性40份，陽性率為67.8％，檢測為陰性的有19份，占32.2％。 結(jié)論:得到了檢測人乳頭瘤病毒的CODEHOP雜交引物，并對其靈敏度和特異性進行了檢測，檢測結(jié)果良好，由于該引物針對的是HPV的高危型，因