人喉癌細胞免疫逃避機制研究.pdf

1、目的： 免疫系統(tǒng)與惡性腫瘤細胞之間相互作用在腫瘤發(fā)生中扮演重要角色。免疫系統(tǒng)不能及時識別及殺傷惡性轉(zhuǎn)化細胞可能會導(dǎo)致癌癥發(fā)生。惡性腫瘤通過多種機制逃避機體的免疫監(jiān)視。目前已知許多這些機制是在細胞和分子水平。其中，腫瘤通過不同機制形成利于自身增殖的微環(huán)境，誘導(dǎo)微環(huán)境中活化T淋巴細胞凋亡而逃逸腫瘤監(jiān)控機制越來越受到重視。 本研究通過觀察人喉癌Hep-2細胞對Jurkat細胞凋亡的影響，探討Fas、FasL促凋亡途徑在人喉癌細

2、胞免疫逃避中的作用；并進一步探討MMP-7調(diào)控Hep-2細胞與腫瘤微環(huán)境中免疫細胞相互作用的機制。通過研究MMP-7、Fas、FasL在喉癌組織的表達，探討其與喉癌患者臨床病理特征的關(guān)系。 方法： 1.應(yīng)用RT-PCR、流式細胞儀檢測Hep-2細胞表面Fas、FasL的mRNA及蛋白表達；Hep-2細胞與Jurkat細胞共培養(yǎng)，應(yīng)用MTT比色試驗描繪Jurkat細胞生長曲線，應(yīng)用Hoechst染色熒光顯微鏡觀察及流式細胞

3、術(shù)檢測Jurkat細胞凋亡情況。 2.采用RT-PCR檢測Hep-2細胞中MMP-7的mRNA表達；采用免疫組化技術(shù)觀察Hep-2細胞MMP-7蛋白的表達情況：用不同終濃度(10ng/mL、100ng/mL、200ng/mL)的重組人MMP-7(RecombinanthumanMMP-7，rhMMP-7)預(yù)處理培養(yǎng)Hep-2細胞，或同時加入MMP-7中和性IgG抗體1.0μg/mL，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測培養(yǎng)上

4、清液中可溶性FasL(solubleFasL，sFasL)水平。分別培養(yǎng)Hep-2細胞及Jurkat細胞，將細胞進行不同處理并分為以下5組，(1)A組：Hep-2細胞培養(yǎng)液中加入活化重組人MMP-7(終濃度100ng/mL)后，收集細胞培養(yǎng)上清液孵育Jurkat細胞(1×105/mL)；(2)B組：Hep-2細胞培養(yǎng)液中加入活化重組人MMP-7(終濃度100ng/mL)預(yù)處理后，收集細胞培養(yǎng)上清液，再加入10μg/mL的FasL中和性抗

5、體NOK-1，孵育1h后，再孵育Jurkat細胞(1×105/mL)；(3)對照1組：直接收集Hep-2細胞單獨培養(yǎng)上清液孵育Jurkat細胞(1×105/mL)；(4)對照2組：普通細胞培養(yǎng)液中加入rhMMP-7(終濃度100ng/mL)預(yù)處理后，孵育Jurkat細胞(1×105/mL)；(5)對照3組：用普通細胞培養(yǎng)液直接孵育Jurkat細胞培養(yǎng)(1×105/mL)；各試驗組在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12及24小時，收集懸

6、浮Jurkat細胞，分別采用MTT比色試驗檢測Jurkat細胞增殖情況；流式細胞儀進行細胞周期檢測；Hoechst染色觀察Jurkat細胞形態(tài)學(xué)變化；流式細胞儀檢測Jurkat細胞凋亡情況； 3.65例配對的喉癌組織和癌旁非瘤組織標本采集自接受手術(shù)的喉癌患者。采用免疫組化染色檢測MMp-7、Fas、FasL的表達情況，分析各檢測指標與喉癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，并進行MMP-7與Fas、FasL相關(guān)性分析。 結(jié)果：

7、 1.流式細胞儀檢測Hep-2細胞表面Fas及FasL表達的平均熒光強度分別為(25.57±7.1)和(32.91±5.6)。Jurkat細胞表面Fas及FasL表達的平均熒光強度分別為(65.39±4.6)和(66.48±5.7)。Hep-2細胞(密度為1×106/mL)分別與的Jurkat細胞(密度為1×105/mL、5×105/mL)共培養(yǎng)24h，流式細胞儀檢測Jurkat細胞凋亡率為(38.95±0.11)％和(13.28±0

8、.14)％，而Jurkat細胞單獨培養(yǎng)的凋亡率為(7.53±0.17)％，共培養(yǎng)組Jurkat細胞較單獨培養(yǎng)Jurkat細胞凋亡率明顯升高(P<0.01)。MTT比色試驗檢測顯示共培養(yǎng)后Jurkat細胞生長受到明顯抑制；當共培養(yǎng)體系中加入FasL中和性抗體NOK-1后，Jurkat細胞凋亡率顯著下降(P<0.01)。 2.RT-PCR檢測顯示Hep-2細胞中表達MMP-7的mRNA；免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，MMP-7在Hep-

9、2細胞呈陽性表達，MMP-7表達于Hep-2細胞胞漿中，而細胞核中表達陰性。分別加入10ng/mL、100ng/mL、200ng/mLrhMMP-7孵育后，Hep-2細胞培養(yǎng)上清中sFasL水平分別為0.83±0.182、1.27±0.244、1.64±0.193(ng/mL)，較單純Hep-2細胞培養(yǎng)上清液水平0.55±0.084(ng/mL)顯著升高(P<0.05)，且上清液中sFasL濃度與MMP-7濃度存在濃度依賴性(P<0.0

10、5)。當加入抗人MMP-7特異性IgG抗體共同孵育，上清液中sFasL含量顯著減少。MTT比色試驗顯示，在A組Jurkat細胞增殖較對照組均明顯降低(P<0.05)，而在B組，Hep-2細胞經(jīng)MMP-7處理后，收集上清并加入NOK-1孵育處理，再將處理后的上清液孵育Jurkat細胞，Jurkat細胞增殖速度明顯恢復(fù)。Jurkat細胞培養(yǎng)12h時，在A組，細胞周期停滯在G0/G1期，相應(yīng)伴隨著S期細胞比例的減少。而G2/M期的細胞比例沒有

11、受到顯著影響。Hoechest染色法對各組Jurkat細胞進行觀察，結(jié)果顯示，A組大量細胞出現(xiàn)了熒光變強，核固縮、碎裂等細胞凋亡的特征性改變，而在NOK-1中和了sFasL作用后及其他對照組，這種典型的細胞凋亡染色改變明顯減少。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，A組Jurkat細胞凋亡率(26.37±1.65)％，較對照組明顯升高(P<0.01)。 3.喉癌組織中MMP-7蛋白陽性率顯著高于癌旁組織(64.6％VS43.1％，P<0.05

12、)；喉癌組織中FasL蛋白陽性率顯著高于癌旁組織(64.6％VS21.5％，P<0.05)；癌旁組織中Fas蛋白陽性率顯著高于喉癌組織(73.8％VS55.4％，P<0.05)；MMP-7在聲門上型與聲門型喉癌組間、不同腫瘤分期組間及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組間的表達有顯著差異(P<0.05)，而在不同病理組織分化組間的表達無顯著差異(P>0.05)；FasL在中低分化喉癌組陽性表達明顯高于在高分化組(P<0.05)，但FasL蛋白表達與臨床分期

13、及是否伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及與腫瘤原發(fā)位置無明顯相關(guān)性(P>0.05)；Fas在高分化組陽性表達顯著高于中低分化喉癌組(P<0.05)，而在不同原發(fā)位置組間、不同腫瘤分期組間及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組間表達無顯著差異(P>0.05)；喉癌組織中MMP-7與Fas表達具有顯著負相關(guān)(P<0.01)，而與FasL表達無顯著相關(guān)性(P>0.05)。 結(jié)論： 1.喉癌細胞與Jurkat細胞共培養(yǎng)能誘導(dǎo)Jurkat細胞凋亡，其機制可能是人喉癌細