解偶聯(lián)蛋白2在酒精性肝病中的表達(dá)及意義.pdf

1、目的：酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是長期大量飲酒所致的肝臟損害性病變，其病理改變包括酒精性脂肪肝、酒精性脂肪性肝炎、酒精性肝纖維化及酒精性肝硬化。關(guān)于ALD的發(fā)病機(jī)理目前尚不清楚，近年來有人提出以氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化為中心的“二次打擊”假說，“第一次打擊”使脂類沉積在肝細(xì)胞，導(dǎo)致脂肪肝，“第二次打擊”涉及內(nèi)毒素、細(xì)胞因子參與的氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化。氧化應(yīng)激和內(nèi)毒素是ALD發(fā)病過程中不可分割的兩個中

2、心環(huán)節(jié)，二者均可激活Kupffer細(xì)胞，活化的Kupffer細(xì)胞通過產(chǎn)生氧自由基和分泌細(xì)胞因子招募中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤引起肝內(nèi)炎癥反應(yīng)參與ALD的發(fā)病。解偶聯(lián)蛋白(uncoupling proteins，UCPs)是線粒體內(nèi)膜上可以調(diào)節(jié)質(zhì)子跨膜轉(zhuǎn)運的載體蛋白，具有解偶聯(lián)活性。目前共發(fā)現(xiàn)5種亞型，分別為UCP1、UCP2、UCP3、UCP4和UCP5，其中UCP2雖無組織特異性，但在正常肝組織中僅在Kupffer細(xì)胞表達(dá)，肝細(xì)胞無表達(dá)

3、或表達(dá)水平很低，當(dāng)肝組織受損時，肝細(xì)胞則大量表達(dá)UCP2。UCP2可以通過調(diào)節(jié)質(zhì)子跨膜轉(zhuǎn)運參與能量消耗和脂質(zhì)代謝，可能參與ALD的氧化應(yīng)激與脂質(zhì)過氧化。本研究旨在應(yīng)用酒精灌胃建立大鼠ALD模型，用免疫組織化學(xué)染色及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)的方法觀察UCP2蛋白及UCP2 mRNA的表達(dá)情況，探討UCP2在ALD發(fā)病過程的表達(dá)及意義，

4、為有效防治ALD提供新的思路。方法：選用雄性健康清潔級Wister大鼠50只，體重200±20g，正常飼養(yǎng)l周后隨機(jī)分出10只為正常對照組，其余動物采用逐漸增加酒精濃度(濃度30％-60％，乙醇5.9g·kg-1·d-1)的方法酒精灌胃，分別于4周、8周、12周和16周末隨機(jī)處死動物8只、8只、8只和9只，留取血清及肝組織標(biāo)本并制備10％的肝勻漿，應(yīng)用日本OLYMPUSAU-600全自動生化分析儀檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine

5、 aminotransferase，ALT)，天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)和乙酰膽堿酯酶(cholinesterase，CHE)；應(yīng)用比色法檢測肝勻漿肝組織蛋白含量，以g(mg)為單位分別測定肝勻漿甘油三酯(triglyceride，TG)、氧自由基(oxygen free radical，OFR)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxid

6、edismutase，SOD)的含量；應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)法檢測血清白細(xì)胞介素1β(interleukin 1 beta，IL-1β)、IL-6和腫瘤壞死因子α(tumornecrosis factor α，TNF-α)；取部分肝組織立即冰凍切片行蘇丹Ⅳ染色，觀察肝細(xì)胞脂變性情況；另取肝組織固定于4％中性福爾馬林溶液，石蠟包埋，5μm切片行蘇木精-伊紅(hema

7、toxylin-eosin，HE)染色觀察肝組織的普通病理改變，天狼紅染色觀察肝組織纖維化程度，DPAS染色觀察肝組織Kupffer細(xì)胞的變化；并用石蠟切片進(jìn)行UCP2免疫組織化學(xué)染色，觀察肝組織UCP2蛋白表達(dá)情況；余肝組織經(jīng)液氮速凍后置于-80℃冰箱，用RT-PCR觀察大鼠肝組織UCP2mRNA的表達(dá)。 結(jié)果：1 血清生化指標(biāo)的變化：隨著造模時間的延長，血清ALT和AST水平逐漸升高，CHE逐漸降低，與正常對照組比較P＜0.

8、05或P＜0.01。 2.血清細(xì)胞因子水平的變化：隨著造模時間的延長，血清IL-1β、IL-6和TNF-α含量逐漸升高，與正常對照組比較P＜0.05或P＜0.01。 3.肝組織勻漿氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化：隨著造模時間的延長，肝組織勻漿TG、OFR及MDA含量逐漸升高，SOD含量逐漸降低，與正常對照組比較P＜0.05或P＜0.01。 4 肝組織病理學(xué)改變：4周大鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)小葉中央靜脈周圍肝細(xì)胞脂肪變性，隨著造模時間的

9、延長，肝細(xì)胞脂肪變性逐漸加重，肝小葉內(nèi)壞死灶明顯增多和纖維組織增生，16周大鼠肝細(xì)胞呈現(xiàn)彌漫小泡性脂肪變性，竇周纖維化，匯管區(qū)纖維組織增生并有纖維間隔形成。冰凍切片蘇丹Ⅳ染色顯示正常對照組大鼠肝組織無脂肪變性，模型4周組大鼠肝細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)少量紅色脂滴，隨著造模時間延長，紅色脂滴逐漸增多，至16周表現(xiàn)為大量紅色脂滴分布于肝細(xì)胞內(nèi)。天狼紅染色顯示模型4周組大鼠肝組織無明顯纖維組織增生，模型12周組大鼠肝組織出現(xiàn)明顯竇周纖維化和纖維化間隔形

10、成趨勢，模型16周組大鼠肝組織出現(xiàn)明顯纖維間隔。 5 Kupffer細(xì)胞的變化：肝組織DPAS染色顯示正常對照組肝組織匯管區(qū)存在少量DPAS陽性細(xì)胞，模型4周組大鼠肝小葉I帶DPAS陽性細(xì)胞增多，隨著造模時間的延長陽性表達(dá)明顯增強，模型16周組大鼠整個肝小葉內(nèi)竇周散在分布DPAS陽性細(xì)胞，胞漿豐富，體積肥大。 6 免疫組化法檢測大鼠肝組織UCP2蛋白的表達(dá)：光鏡下，正常組大鼠肝臟內(nèi)僅表達(dá)少量UCP2蛋白，隨著造模時間的延

11、長陽性表達(dá)逐漸增強，主要表達(dá)于肝細(xì)胞胞漿內(nèi)。 7 RT-PCR法檢測UCP2 mRNA的表達(dá)量：正常組大鼠肝組織中僅表達(dá)少量UCP2 mRNA，隨著造模時間的延長，其表達(dá)量逐漸增加，與正常對照組比較P＜0.05。 8 肝組織中UCP2的相對表達(dá)量與血清ALT、AST水平呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.38和0.63，P值分別為.P＜0.05和P＜0.01，與CHE呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.43，P＜0.01。 9 肝組織中U

12、CP2的相對表達(dá)量與血清細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.85，0.75和0.70，P值均＜0.01。 10 肝組織中UCP2的相對表達(dá)量與肝勻漿中氧化指標(biāo)TG、OFR和MDA的含量呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.75、0.74和0.73，P值均＜0.01，與抗氧化指標(biāo)SOD呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.55，P＜0.01。 結(jié)論：1 應(yīng)用逐漸增加酒精濃度和劑量灌胃的方法可以成功制備大鼠A

13、LD模型，該模型肝臟病變?nèi)缰咀冃?、炎癥反應(yīng)和纖維化等可以反映臨床ALD的基本病變。 2.ALD發(fā)病過程中存在氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激參與ALD的發(fā)病過程。 3.ALD發(fā)病過程中存在Kupffer細(xì)胞的活化與增生，活化的Kupffer細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，在ALD發(fā)病過程中的發(fā)揮重要作用。 4 ALD發(fā)病過程中UCP2表達(dá)逐漸增強，高表達(dá)的UCP2與血清促炎性細(xì)胞因子變化呈正相關(guān)，是影響ALD肝臟炎癥損傷的重要因