‘突尼斯軟子’石榴遺傳轉(zhuǎn)化體系建立及轉(zhuǎn)化ICE1基因的研究.pdf

1、石榴在中國具有悠久的栽培歷史，并被廣泛種植。由于石榴具有較高的營養(yǎng)、經(jīng)濟(jì)價值和保健功能，近年來石榴越來越受到消費市場的青睞，石榴產(chǎn)業(yè)在國內(nèi)外迅速發(fā)展?！荒崴管涀印窬哂休^強的抗旱、抗病性，栽培適應(yīng)范圍廣，但其抗寒性較差，冬季溫度低于-10℃時，樹體容易受凍害，抗寒性差制約其在中國范圍內(nèi)的推廣和栽培。
　　隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)出現(xiàn)，尤其是植物組織培養(yǎng)和基因工程的發(fā)展，為石榴品種定向改良和選育新品種提供技術(shù)支持;而遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的迅

2、速發(fā)展使快速培育石榴抗寒新種質(zhì)成為可能。本試驗以‘突尼斯軟子’石榴胚培苗的子葉、葉片、上胚軸和下胚軸為外植體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，通過比較GUS瞬時表達(dá)翠對不同的預(yù)培養(yǎng)時間、菌液濃度、侵染時間、共培養(yǎng)時間、AS濃度進(jìn)行優(yōu)化，建立‘突尼斯軟子’石榴四種不同外植體的高效遺傳轉(zhuǎn)化再生體系;并在此基礎(chǔ)上，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將抗寒基因ICE1轉(zhuǎn)入石榴基因組，對轉(zhuǎn)化所得抗性芽進(jìn)行PCR檢測;此外，為解決石榴遺傳轉(zhuǎn)化研究中不定芽生根率低的

3、問題，對石榴試管嫁接技術(shù)進(jìn)行初步的研究。主要研究結(jié)果如下:
　　1.石榴四種不同外植體遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立
　　通過比較GUS瞬時表達(dá)率，確定四種材料預(yù)培養(yǎng)天數(shù)、菌液濃度、侵染時間、乙酰丁香酮濃度、共培養(yǎng)天數(shù)等的最適處理。結(jié)果表明，以子葉為外植體時，預(yù)培養(yǎng)3d，菌液濃度OD600為0.5，常規(guī)方法侵染25min，共培養(yǎng)時培養(yǎng)基中添加30.0mg/L乙酰丁香酮，共培養(yǎng)3d時GUS瞬時表達(dá)率最高，為60.0％,外植體為葉片時，預(yù)培

4、養(yǎng)3d，菌液濃度OD600為0.7，常規(guī)方法侵染25min，共培養(yǎng)時培養(yǎng)基中添加20.0mg/L乙酰丁香酮，共培養(yǎng)3d時GUS瞬時表達(dá)率最高，為73.3％;試驗材料為上胚軸時，預(yù)培養(yǎng)2d，菌液濃度OD600為0.5，侵染20min，共培養(yǎng)時培養(yǎng)基中添加30.0mg/L乙酰丁香酮，共培養(yǎng)3d后GUS瞬時表達(dá)率最高，為70.0％;以下胚軸為外植體時，預(yù)培養(yǎng)2d，菌液濃度OD600為0.5，侵染25min，共培養(yǎng)時培養(yǎng)基中添加30.0mg/L

5、乙酰丁香酮，共培養(yǎng)3d時GUS瞬時表達(dá)率最高，為73.3％。
　　2.農(nóng)桿菌介導(dǎo)石榴不同外植體轉(zhuǎn)化ICE1基因
　　本試驗以石榴胚培苗子葉、葉片、上胚軸和下胚軸為外植體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行ICE1基因遺傳轉(zhuǎn)化研究，初步獲得大量抗性愈傷組織和少量抗性芽;但對獲得的抗性芽進(jìn)行PCR檢測沒有得到目的條帶;抗性愈傷組織的擴(kuò)繁和后續(xù)試驗正在進(jìn)行中。
　　3.石榴試管嫁接技術(shù)研究
　　在石榴遺傳轉(zhuǎn)化的研究中發(fā)現(xiàn)外植體誘導(dǎo)出