腫瘤相關(guān)抗原的抗體檢測(cè)在原發(fā)性肝癌診斷中的價(jià)值.pdf

1、背景和目的：原發(fā)性肝癌是全球常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,特別是在亞洲和非洲。全球每年有60萬(wàn)人死于肝癌,我國(guó)每年有約32萬(wàn)人死于肝癌,其發(fā)病率和死亡率均占惡性腫瘤中的第二位。肝癌患者往往在確診后一年內(nèi)死亡,如此高的發(fā)病率和死亡率歸因于缺乏一種早期診斷的方法。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤病人血清中存在有各種類型的抗細(xì)胞自身抗原的抗體,這些與腫瘤發(fā)生有關(guān)的抗原被稱為腫瘤相關(guān)抗原(tumor-associated antigen,TAA),對(duì)血清中存在的抗

2、TAA抗體的檢測(cè)可以用于肝癌的早期診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)。肝癌的顯著特征多由一些肝炎及肝硬化病人發(fā)展而來(lái),研究者發(fā)現(xiàn)在一些從慢性肝炎、肝硬化而逐漸發(fā)展為肝癌的患者血清中,出現(xiàn)了在癌前病變前期沒(méi)有的自身抗體。這就為肝癌的早期診斷提供了一個(gè)新的思路,但是單個(gè)抗體的靈敏度往往不高,有學(xué)者提出一個(gè)全新的概念,即把多種與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)抗原的抗體系統(tǒng)結(jié)合起來(lái)綜合考慮和評(píng)價(jià)其在腫瘤發(fā)生中的意義。
　　材料與方法：1.樣本采集:研究對(duì)象共268例,分為

3、兩組,肝癌組115例,所有115例肝癌血清標(biāo)本均采集自首次到醫(yī)院就診,并經(jīng)組織病理學(xué)確診、沒(méi)有經(jīng)過(guò)任何化療和放療的肝癌患者;正常組153例,正常對(duì)照均為進(jìn)行健康體檢并證實(shí)沒(méi)有任何腫瘤相關(guān)疾患的健康成人。2.應(yīng)用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)115例原發(fā)性肝癌患者血清和153例正常人血清中的14種抗TAA(針對(duì)14個(gè)抗原Calnuc、CyclinE、CDK2、cIAP、RalA、p62、p53、CyclinB1、Koc、Impl、

4、survivin、CyclinD1、p16、C-myc)的自身抗體,利用流行病學(xué)方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果的真實(shí)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。3.對(duì)本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)異體血清篩選出來(lái)的在肝癌患者、肝炎以及正常人中有差別的基因AHSG基因進(jìn)行克隆。
　　結(jié)果一種抗原單獨(dú)檢測(cè)結(jié)果:1.大多數(shù)指標(biāo)的靈敏度偏低,最高的為32.2％,但是肝癌患者抗體陽(yáng)性率明顯高于正常人。2.具有乙肝的肝癌患者、無(wú)肝炎(無(wú)乙肝和丙肝,簡(jiǎn)稱無(wú)肝炎)的肝癌患者和正常人之間,靈敏度具有顯著差異,具有乙

5、肝的肝癌患者的抗體陽(yáng)性率明顯高于無(wú)肝炎肝癌患者和正常人的陽(yáng)性率?？乖?lián)合檢測(cè)結(jié)果:1.14種TAA進(jìn)行不同的組合,逐漸增加抗原數(shù)目進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果隨著檢測(cè)抗體的增多,靈敏度顯著升高,抗原數(shù)目增加到8種(CyclinE、Koc、Impl、cIAP、p62、p16,Cyclin B1和Calnuc)時(shí),靈敏度達(dá)到最高,本實(shí)驗(yàn)中,8種抗原組合為最適宜組合。聯(lián)合8種TAA檢測(cè)的靈敏度增加到72.2%,特異度達(dá)到91.2%,陽(yáng)性似然比為8.49,陰

6、性似然比為0.304,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為86.5%,陰性預(yù)測(cè)值為81.4%,說(shuō)明8種TAA聯(lián)合檢測(cè)肝癌的診斷價(jià)值較高;Kappa值為0.65,提示該試驗(yàn)的診斷結(jié)果與真實(shí)值之間中度一致。2.8種抗原聯(lián)合檢測(cè)在男女肝癌患者之間陽(yáng)性率不存在差別。按年齡把肝癌患者分為三層,小于50歲,50歲到60歲之間,大于60歲,進(jìn)行TAA聯(lián)合檢測(cè),差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,大于60歲組肝癌患者抗體陽(yáng)性率最高。3.8種TAA聯(lián)合檢測(cè)和AFP檢測(cè)肝癌之間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,

7、但是在AFP檢測(cè)陰性的13例肝癌患者中,TAA檢測(cè)有10例為陽(yáng)性,把TAA檢測(cè)和AFP檢測(cè)進(jìn)行并聯(lián)篩檢,肝癌檢出率91.0%(32/35),遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于AFP62.99%(22/35)和TAA的65.7%(23/35),且并聯(lián)檢測(cè)和AFP、TAA單獨(dú)檢測(cè)差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AHSG基因克隆結(jié)果:1.含AHSG基因的重組質(zhì)粒pMD18-T-Ahsg(簡(jiǎn)稱pTA),經(jīng)雙酶切后得到克隆載體片段(2.7kb)和目的基因AHSG片段(1104bp),

8、特異PCR可擴(kuò)增出1104bp的AHSG基因片段,證實(shí)AHSG基因的重組克隆質(zhì)粒構(gòu)建成功。經(jīng)測(cè)序,AHSG基因全長(zhǎng)1104bp,編碼由367個(gè)氨基酸殘基組成的肽鏈,蛋白質(zhì)分子量為39KD,將AHSG測(cè)序結(jié)果采用NCBI的網(wǎng)上序列分析軟件BLAST進(jìn)行cDNA序列的同源性比較、分析,結(jié)果顯示,發(fā)現(xiàn)有7個(gè)核苷酸差異,同源性為99%。
　　結(jié)論：1.用8種TAA抗體組合檢測(cè)肝癌具有較高的真實(shí)性,可作為現(xiàn)場(chǎng)高危人群篩檢和臨床中肝癌診斷的一