TNF-α抗體對大鼠肝肺綜合征治療作用機制的研究.pdf

1、肝肺綜合征（Hepatopulmonary Syndrome，HPS）是一種與肝病有關(guān)的肺血管擴張所致的以動脈氧合下降為主要表現(xiàn)的臨床綜合征。其病理基礎(chǔ)是肺血管擴張。其發(fā)病機制尚不明確，但大多認為是擴血管因子一氧化氮（nitric oxide NO）產(chǎn)生過多造成的。
　　 NO是由一氧化氮合酶（nitricoxide synthase，NOS）以L一精氨酸為底物催化而成，NOS有三種異構(gòu)體形式，即神經(jīng)原型（nNOS）、內(nèi)皮型（e

2、NOS）和誘導(dǎo)型（iNOS）。其中eNOS和nNOS又合稱為原生型（constitutiveNOS，cNOS），主要存在于內(nèi)皮細胞、神經(jīng)細胞和血小板等，誘導(dǎo)合成正常生理需要量的NO。而iNOS主要存在于巨噬細胞、中性粒細胞、免疫細胞等。正常狀態(tài)下細胞內(nèi)iNOS表達水平較低，經(jīng)細胞因子及內(nèi)毒素等誘導(dǎo)，iNOS表達增多。iNOS的作用時問長，可催化生成大量NO。iNOS的表達是一個復(fù)雜的過程，許多翻譯前及翻譯后因素參與其中，包括TNF-α在

3、內(nèi)的多種致炎因子和/或細胞因子，均可刺激iNOS的轉(zhuǎn)錄。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）是一種促炎性細胞因子，在免疫反應(yīng)、炎癥和對損傷反應(yīng)中起重要作用，主要影響細胞增殖和細胞凋亡的調(diào)節(jié)，不僅對腫瘤細胞有細胞毒/細胞溶解、抑制增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡等作用，還影響多種正常細胞的生長分化，并與其他細胞因子一起形成復(fù)雜的免疫網(wǎng)絡(luò)。TNF-α主要是由單核-巨噬細胞分泌，其他類型的細胞如淋巴細胞、平

4、滑肌細胞、成纖維細胞等在一定條件下也具有產(chǎn)生和釋放TNF-α的能力。
　　 肝肺綜合征在肝硬化患者中的發(fā)病率為10％-30％。目前，肝肺綜合征最有效的治療方法為肝移植，但由于肝源的有限性，使很多患者不能得到及時的治療。因此，肝肺綜合征藥物治療的研究尤為重要。有研究表明TNF-α抑制劑己酮可可堿在HPS大鼠模型中實驗可以減少NO的形成量，因此受到啟發(fā)TNF-α單克隆抗體是否可以阻斷此信號傳導(dǎo)通路呢，而且目前TNF-α單克隆抗體已應(yīng)

5、用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、糖尿病、心肌炎等炎癥性疾病的治療。本實驗采用TNF-α單克隆抗體對大鼠肝肺綜合征模型進行實驗性治療，以便為HPS的臨床治療提供理論基礎(chǔ)。
　　 目的：制作大鼠肝肺綜合征動物模型，通過腹腔注射腫瘤壞死因子-α單克隆抗體，研究抑制TNF-α表達后NO、iNOS的表達的影響以及肺功能的變化。
　　 方法：采用膽總管結(jié)扎（common bile duct ligation，CBDL）大鼠肝肺綜合征模型，將60只

6、雄性Sprague Dawley大鼠隨機分成假手術(shù)組（Sham組）、模型組和干預(yù)組。模型組分別于結(jié)扎后1wk、2wk、3wk、4wk、5wk麻醉動物，干預(yù)組于結(jié)扎后第2周開始腹腔注射腫瘤壞死因子-α單克隆抗體（0.1mg/kg/2d）于干預(yù)后1wk、2wk、3wk、4wk麻醉動物，假手術(shù)組與5wk模型組動物同批麻醉，留取肝組織、肺組織、血標本。采用HE染色確定模型建立情況，Masson三色染色觀察肝硬化形成情況及干預(yù)組與模型組的對比；通

7、過檢測血氣分析、NO來了解肺功能的變化；免疫組織化學(xué)方法檢測iNOS在HPS形成過程不同時期及干預(yù)后不同時期肺組織中分布及含量的動態(tài)變化；采用Western blot及RT-PCR方法分別檢測iNOS在HPS形成及干預(yù)過程中肺組織中mRNA及蛋白表達情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、肝臟及肺臟病理改變
　　 CBDL組肝臟病理HE及Masson染色顯示肝臟小膽管廣泛增生，膽管擴張，纖維組織增生，假小葉形成。干預(yù)組大

8、鼠肝臟HE染色顯示小葉結(jié)構(gòu)變化不明顯，小膽管仍有增生；Masson染色顯示門管區(qū)膠原纖維輕微增多，未見假小葉形成。假手術(shù)組HE染色肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝板排列整齊；Masson三色染色僅在門管區(qū)可見少量結(jié)締組織。
　　 CBDL組肺臟HE染色顯示大鼠肺臟肺泡隔增寬，肺間質(zhì)內(nèi)炎癥反應(yīng)明顯，可見巨噬細胞。肺間質(zhì)毛細血管密度有所增加，提示肺間質(zhì)血管擴張、充血，部分區(qū)域的肺泡腔略變小。干預(yù)組肺臟毛細血管輕度擴張，肺泡間隔輕度增寬。假手術(shù)組肺

9、泡呈半球形的小囊，肺泡壁薄，相鄰肺泡之間可見由薄層結(jié)締組織構(gòu)成的肺泡隔，肺泡內(nèi)有連續(xù)的毛細血管和彌散存在的肺巨噬細胞。
　　 2、肝功能檢測：
　　 血漿ALT及TBIL在CBDL術(shù)后造模組1周明顯增加，與Sham組比較P<0.05，有明顯差異。之后雖逐漸下降，但均明顯高于Sham組。TNF-α單克隆抗體干預(yù)治療后1周即較同周CBDL組明顯下降，P<0.05，有明顯差異。之后，呈下降趨勢，但仍明顯高于Sham組。

10、　　 3、血漿TNF-α檢測：
　　 CBDL術(shù)后1周血漿TNF-α水平即明顯升高，之后呈上升趨勢，3周時血漿TNF-α水平達高峰，4周時有所回落，5周又開始回升，但均明顯高于Sham組。TNF-α單克隆抗體干預(yù)治療后1周即開始明顯降低，之后繼續(xù)下降，至干預(yù)治療后4周仍高于同周Sham組。
　　 4、動脈血氣分析檢測：
　　 CBDL造模2周肺泡-動脈氧分壓梯度差P（A-a）O2開始出現(xiàn)增大，與Sham組比較P

11、<0.05，有明顯差異。之后呈上升趨勢。TNF-α單克隆抗體干預(yù)治療后2周較CBDL術(shù)后同周組開始下降，之后呈下降趨勢，至3周P（A-a）O2與同周CBDL組比較P<0.05，有明顯差異。但仍明顯高于Sham組。
　　 5、NO檢測結(jié)果：
　　 術(shù)后1周NO開始上升，與Sham組比較P<0.05，有明顯差異。至3周末達到高峰后呈下降趨勢，但均明顯高于Sham組。TNF-α單克隆抗體干預(yù)治療后1周即開始明顯降低，之后繼續(xù)下

12、降，至干預(yù)治療后3周仍高于Sham組，但無明顯差異。
　　 6、肺組織iNOS的表達
　　 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，CBDL組iNOS蛋白陽性表達較多，可見細胞胞漿呈棕褐色細顆粒，陽性表達細胞多集中于吞噬細胞胞漿中；與Sham組比較P<0.05，有明顯差異。TNF-α單克隆抗體干預(yù)后iNOS蛋白表達下降，表現(xiàn)為陽性著色變少，但均明顯高于Sham組。
　　 Western blot分析iNOS蛋白表達，在130KD的

13、位置上出現(xiàn)雜交帶，從雜交信號強度可知，CBDL術(shù)后造模組1周肺組織iNOS蛋白表達即開始明顯增加，與Sham組比較P<0.05，有明顯差異。至2周達高峰，之后又下降，并在一定范圍波動。TNF-α單克隆抗體干預(yù)治療后1周開始明顯下降，與同周CBDL組比較，P<0.05，有顯著性差異；至干預(yù)后3周末與同周CBDL組有明顯差異，p<0.05；但與Sham組無明顯差異，p>0.05。
　　 RT-PCR擴增檢測iNOS mRNA表達實驗

14、結(jié)果與上述兩種方法結(jié)果一致。
　　 結(jié)論：
　　 1、進一步證實了在肝肺綜合征的形成過程中，肝臟功能改變是肺功能變化的基礎(chǔ)。
　　 2、肝硬化動物HPS的發(fā)生與TNF-α密切相關(guān)。
　　 3、iNOS源性NO是HPS形成機制中重要的因子。
　　 4、應(yīng)用TNF-α單克隆抗體干預(yù)治療，可通過中和血漿TNF-α，部分降低血漿TNF-α水平、iNOS蛋白表達，NO生成減少，從而部分改善HPS的嚴重程度。