電刺激小腦頂核對(duì)大鼠局灶腦缺血-再灌注后腦內(nèi)成體神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的影響及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、缺血性腦卒中是神經(jīng)系統(tǒng)的常見病和多發(fā)病，在腦卒中約占75％。大多數(shù)患者中遺留有癱瘓、失語等嚴(yán)重后遺癥，給患者帶來極大的痛苦，同時(shí)也給社會(huì)和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。腦缺血/再灌注損傷使腦組織的功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷更加嚴(yán)重，使治療效果大大降低。因此如何采取合理的措施預(yù)防和治療缺血性腦血管病，恢復(fù)受損神經(jīng)細(xì)胞功能，降低致殘率和病死率，近年來已成為醫(yī)學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)課題。腦缺血/再灌注損傷是一復(fù)雜的病理生理過程，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)破壞和缺失可能是引起功能障礙的

2、病理關(guān)鍵。目前還沒有理想的治療腦缺血/再灌注損傷的方法。研究發(fā)現(xiàn)電刺激小腦頂核對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病有神經(jīng)保護(hù)作用，可以抗炎癥、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)神經(jīng)組織的結(jié)構(gòu)重建等作用。目前，采用仿生物電，模擬實(shí)驗(yàn)性小腦頂核電刺激而研制的小腦電刺激儀已廣泛應(yīng)用于許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床治療，對(duì)多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病都產(chǎn)生了比較肯定的臨床效果。Notch1是控制細(xì)胞命運(yùn)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。當(dāng)Notch1被激活后，神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行增殖，而當(dāng)Notch1活性被抑制時(shí)，干細(xì)胞

3、則進(jìn)入分化程序。bHLH基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（包括Hes5和Mash1）是指由一個(gè)堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)及其上游富含堿性氨基酸序列的核酸順序組成的一類基因，可以調(diào)控許多基因的轉(zhuǎn)錄。研究表明，Hes5信號(hào)通路能抑制神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖。Mash1的高表達(dá)可促進(jìn)干細(xì)胞的分化，相反低表達(dá)則抑制干細(xì)胞的分化，使干細(xì)胞處于持續(xù)的增殖狀態(tài)。核轉(zhuǎn)錄因子-κB對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化作用機(jī)制十分復(fù)雜，通過對(duì)眾多涉及炎癥和免疫反應(yīng)等方面

4、的基因調(diào)控來影響神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化?；谝酝鶎?shí)驗(yàn)研究與臨床的成果，本實(shí)驗(yàn)從電刺激小腦頂核干預(yù)局灶腦缺血/再灌注損傷內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的研究入手，進(jìn)一步探討電刺激小腦頂核對(duì)大鼠局灶腦缺血/再灌注損傷腦組織神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化的影響及其作用機(jī)制，為缺血性腦血管病的治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 目的: 1.觀察電刺激小腦頂核對(duì)大鼠局灶腦缺血/再灌注神經(jīng)行為學(xué)、神經(jīng)功能缺損的影響以及腦組織的含水量、腦梗死體積的變化。 2.觀察局灶腦

5、缺血/再灌注各時(shí)間點(diǎn)大鼠成體神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化及電刺激小腦頂核對(duì)局灶腦缺血/再灌注大鼠成體神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化的影響，探討電刺激小腦頂對(duì)局灶腦缺血/再灌注后神經(jīng)重建的作用。 3.觀察電刺激小腦頂核對(duì)大鼠局灶腦缺血/再灌注大鼠大腦缺血側(cè)皮質(zhì)Notch1、Hes5、Mash1和NF-κB p65 mRNA和蛋白表達(dá)的變化，進(jìn)一步探討電刺激小腦頂核對(duì)大鼠局灶腦缺血/再灌注后腦內(nèi)成體神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化影響的作用機(jī)制。 方法:

6、 1.改良線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈局灶腦缺血1.5h再灌注模型。成年SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（N組），假手術(shù)組（S組），缺血/再灌注組（I/R組），缺血/再灌注后小腦頂核假刺激組（SF組），缺血/再灌注后小腦頂核刺激（F）組。根據(jù)再灌注時(shí)間的不同又分為1d、3d、7d3個(gè)亞組。對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分以及測量腦組織的含水量、腦梗死體積的變化。 2.制備大腦中動(dòng)脈局灶腦缺血1.5h再灌注模型。成年SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照

7、組（N組），假手術(shù)組（S組），缺血/再灌注組（I/R組），缺血/再灌注后小腦頂核刺激（F）組。根據(jù)再灌注時(shí)間的不同又分為3d、7d、14d、28d4個(gè)亞組，每個(gè)亞組動(dòng)物數(shù)n=7只。免疫熒光單標(biāo)和雙標(biāo)法檢測研究局灶腦缺血/再灌注及電刺激小腦頂核對(duì)缺血/再灌注大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的增殖的動(dòng)態(tài)變化和分化的結(jié)果。 3.改良線栓法制備大腦中動(dòng)脈局灶腦缺血1.5h再灌注模型。成年SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（S組），缺血/再灌注組（I/R組），缺血/

8、再灌注后小腦頂核刺激（F）組。根據(jù)再灌注時(shí)間的不同又分為14d、28d2個(gè)亞組，每個(gè)亞組動(dòng)物數(shù)n=7只。采用RT-PCR和Western blotting檢測局灶腦缺血/再灌注及電刺激小腦頂核對(duì)大鼠局灶腦缺血/再灌注后Notch1、Hes5和Mash1 mRNA及蛋白的表達(dá)，采用RT-PCR和免疫組化技術(shù)檢測NF-κB p65 mRNA及蛋白的表達(dá)。 結(jié)果: 1.電刺激小腦頂核能提高局灶腦缺血/再灌注大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)

9、分，降低缺血側(cè)腦組織中腦含水量，縮小腦梗死體積。 2.正常對(duì)照組和假手術(shù)組側(cè)腦室區(qū)和缺血周圍皮質(zhì)只存在少量Brdu陽性細(xì)胞，局灶腦缺血/再灌注腦損傷后3d大鼠側(cè)腦室下區(qū)Brdu陽性細(xì)胞顯著增加（P<0.01），7d時(shí)增加達(dá)到頂鋒（P<0.01），14d和28d時(shí)后Brdu陽性細(xì)胞仍增加（P<0.01）；局灶腦缺血/再灌注腦損傷后3d大鼠缺血周圍皮質(zhì)Brdu陽性細(xì)胞也顯著增加（P<0.001），7d時(shí)增加達(dá)到頂峰（P<0.001）

10、，14d和28d時(shí)后Brdu陽性細(xì)胞仍顯著增加（P<0.001）；電刺激小腦頂核后大鼠側(cè)腦室下區(qū)和缺血周圍皮質(zhì)Brdu陽性細(xì)胞增加更明顯，與缺血/再灌注組比較，在3d、7d、14d和28d四個(gè)時(shí)間點(diǎn)Brdu陽性細(xì)胞增加更多，均有顯著性差異（P<0.05）。免疫熒光雙標(biāo)法顯示在正常組、假手術(shù)組僅見極少量Brdu/GFAP和Brdu/DCX雙陽性細(xì)胞，缺血/再灌注組可見少量Brdu/GFAP和Brdu/DCX雙陽性細(xì)胞，小腦頂核刺激組可見大

11、量Brdu/GFAP和Brdu/DCX雙陽性細(xì)胞，Brdu/GFAP和Brdu/DCX雙陽性細(xì)胞明顯增多，主要分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。 3.與假手術(shù)組比較，腦缺血/再灌注組和腦缺血/再灌注后小腦頂核刺激組Notch1、Hes5、Mash1 mRNA和蛋白的表達(dá)量均增加（P<0.01）；與腦缺血/再灌注組比較，小腦頂核刺激組Notch1、Hes5、Mash1 mRNA和蛋白的表達(dá)量增加更明顯（P<0.05）。與假手術(shù)組比較，腦

12、缺血/再灌注組和腦缺血/再灌注后小腦頂核刺激組NF-κB p65 mRNA和蛋白的表達(dá)量均增加（P<0.01）；與腦缺血/再灌注組比較，小腦頂核刺激組NF-κBp65 mRNA和蛋白的表達(dá)量明顯降低（P<0.05）。 結(jié)論: 1.成功建立改良線栓法大鼠局灶腦缺血/再灌注模型。電刺激小腦頂核可以降低腦缺血/再灌注損傷后急性期死亡率，促進(jìn)肢體功能恢復(fù)。電刺激小腦頂核能提高大腦中動(dòng)脈局灶腦缺血/再灌注模型大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分

13、，降低缺血側(cè)腦組織中腦含水量，縮小腦梗死體積，從而達(dá)到腦保護(hù)作用 2.腦缺血后自身的神經(jīng)干細(xì)胞也存在增殖。在正常對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠SVZ和缺血側(cè)皮質(zhì)有少量神經(jīng)干細(xì)胞，未見神經(jīng)干細(xì)胞增殖。內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖在腦缺血再灌注后逐漸升高，在腦梗死后7d達(dá)到高峰，以后增殖逐漸下降，28d神經(jīng)干細(xì)胞仍有增殖。電刺激小腦頂核后神經(jīng)干細(xì)胞增殖更明顯，在7d達(dá)到高峰，28d后在SVZ和缺血周圍皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞均還有明顯增殖。電刺激小腦頂核能促進(jìn)

14、腦缺血后大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。在正常組、假手術(shù)組僅見極少量神經(jīng)干細(xì)胞分化，缺血/再灌注組可見少量神經(jīng)干細(xì)胞分化，小腦頂核刺激組可見大量神經(jīng)干細(xì)胞分化，分化明顯增多，分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元。電刺激小腦頂核促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)膠質(zhì)樣細(xì)胞和神經(jīng)元樣細(xì)胞。電刺激小腦頂核通過促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化發(fā)揮腦組織神經(jīng)重建作用。 3.正常成年大鼠腦組織Notch1、Hes5、Mash1和NF-κB p65表達(dá)較少。局灶腦缺血