急性心肌缺血大鼠心肌a輔肌動蛋白含量變化及其與心功能的關(guān)系.pdf

1、急性心肌缺血是臨床上常見的心血管急癥,也是造成急性死亡的重要原因,最常見于急性冠脈綜合征。然而隨著溶栓、冠脈搭橋手術(shù)以及冠脈擴張手術(shù)等治療措施的應(yīng)用,臨床上發(fā)現(xiàn)缺血心肌恢復(fù)血流供應(yīng)以后,心功能的改善并不能達到預(yù)期效果,可見心肌在缺血過程中發(fā)生了不可逆的損傷。
　　 目前有證據(jù)表明,缺血心肌中細胞骨架最早發(fā)生不可逆的損傷,如actin在缺血30 min、vinculin在缺血90 min后就會明顯減少。本實驗室前期研究也提示,內(nèi)毒

2、素血癥大鼠心肌細胞內(nèi)actin、desmin、tubulin等骨架蛋白含量的減少是導(dǎo)致心肌舒縮功能減低的原因之一。由此可見,心肌細胞骨架蛋白在心肌舒縮功能的調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用。
　　 對于心肌細胞而言,F-actin既是收縮蛋白也是骨架蛋白,并通過多種肌動蛋白連接蛋白將其定位于心肌細胞膜和心肌細胞Z帶上,借以執(zhí)行心肌收縮舒張功能。α-輔肌動蛋白(α-actinin)就是其中一種連接蛋白,它將肌動蛋白連接成束,傳導(dǎo)肌小節(jié)之間的機

3、械力,一旦α-actinin出現(xiàn)變化將會直接影響心肌細胞的收縮舒張功能。因此本研究觀察了急性心肌缺血與細胞骨架蛋白α-actinin之間的聯(lián)系,并探索其與心肌細胞功能障礙的關(guān)系及可能機制。
　　 本實驗分兩部分。第一部分:實驗分為假手術(shù)組(sham),缺血30 min組(I30min、),缺血60 min組(I60min),缺血60 min再灌注2 h組(IR)。通過結(jié)扎大鼠冠狀動脈左前降支(LAD)建立急性心肌缺血及再灌注模型

4、,觀察心肌缺血對心肌收縮和舒張功能的影響,并通過組織學(xué)及免疫組化方法觀察心肌組織形態(tài)改變和α-actinin分布及含量的變化。綜合評價急性冠狀動脈左前降支缺血對心肌的損傷作用,探討α-actinin是否因缺血受到破壞,α-actinin的破壞是否是心肌收縮舒張功能下降的原因之一。并同時用ELISA方法檢查心肌組織磷酸肌醇3激酶(PI3K)、磷脂酶C(PLC)含量的變化,觀察其在心肌缺血過程中與心肌功能改變和α-actinin含量變化之間

5、的關(guān)系。
　　 第二部分:我們急性分離大鼠心肌細胞,在細胞水平模擬缺氧條件下初步探討急性心肌缺氧時α-actinin與F-actin分布、形態(tài)和數(shù)量的改變,并應(yīng)用P13K抑制劑(LY-29400)和PLC抑制劑(U-73122)對缺氧的心肌細胞進行干預(yù),觀察這兩條激酶途徑是否在心肌缺氧時對α-actinin含量及心肌功能產(chǎn)生的影響,從而進一步深入探討急性心肌缺血時心肌細胞骨架蛋白α—actinin及心功能變化的發(fā)生機制。

6、　　 結(jié)果:
　　 第一部分
　　 (一)急性冠狀動脈左前降支缺血再灌注對大鼠心功能的影響不同處理組之間左心室收縮壓(LNSP)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=12.799,P=0.000)；隨冠脈缺血時間延長,大鼠INSP逐漸下降；再灌注后部分回升,但仍低于sham組(P=0.001)；從各時間點看,缺血60 min后LVSP最低。I30mim組、I60min組、IR組分別與sham組相比,LVSP差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為

7、0.001、0.000、0.001)。而I30min組、IR組與I60min組相比,LVSP差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為0.033,0.037)。
　　 不同處理組之間左心室舒張末壓(LVEDP)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=14.965,P=0.000)；隨冠脈缺血時間延長,大鼠INEDP逐漸升高,再灌注后部分回落,但仍高于sham組(P=0.000)。從各時間點看,缺血60 min后LVEDP最高。采用LSD兩兩比較發(fā)現(xiàn),I30mi

8、n組、I60min組、IR組分別與sham組相比,LVEDP差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均為0.000)。而I30min組與I60min組相比,LVEDP差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.037)。
　　 不同處理組之間左室內(nèi)壓上升最大速率(+dp/dt max)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=16.532,P=0.000)；隨冠脈缺血時間延長,大鼠+dp/dt max逐漸下降,再灌注后部分回升,但仍低于sham組(P=0.000)。從各時間點看,缺血

9、60 min后+dp/dtmax最低。I30min組、I60min組、IR組分別與sham組相比,+dp/dt max差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均為0.000)。
　　 不同處理組之間左室內(nèi)壓下降最大速率(-dp/dt max)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.995,P=0.000):sham組大鼠-dp/dt max最大,隨缺血冠脈時間延長,大鼠-dp/dt max逐漸下降,再灌注后部分回升,但仍低于sham組(P=0.001)。從各時

10、間點看,缺血60 min后-dp/dt max最低。I30min組、I60min組、IR組分別與sham組相比,-dp/dt max差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為0.002、0.000、0.001)。
　　 (二)缺血心肌組織病理檢查結(jié)果sham組心肌組織未見明顯病理學(xué)改變,心肌纖維排列整齊,細胞形態(tài)良好,結(jié)構(gòu)完整,橫紋清晰:I30min組心肌纖維排列變疏松,心肌間質(zhì)有紅細胞滲出；I60min組部分心肌呈波浪狀改變及心肌纖維嗜酸性

11、改變,肌漿嗜伊紅性減弱,間質(zhì)水腫,橫紋模糊,心肌纖維斷裂,可見游離細胞核；IR組仍可見心肌纖維斷裂,膜下空泡,肌漿嗜伊紅性同sham組。
　　 (三)心肌組織α-actinin免疫組化檢測結(jié)果以肌纖維中棕黃色或棕褐色為α-actinin陽性表達。α-actinin主要沿心肌Z線呈條帶狀分布,sham組中α-actinin分布規(guī)則,染色均勻,與橫紋排列一致。隨冠脈缺血時間延長,I30min組、I60min組α-acinin分布不均

12、,出現(xiàn)點狀甚至大片缺失。IR組α-acinin染色不均,少量缺失,但灰度值高于缺血組。不同處理組之間α-actinin灰度值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=12.802,P=0.000)。I60min組α-actinin灰度值最低,分別與sham組、I30min組、IR組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為0.000、0.024、0.039)。
　　 (四)心肌組織PI3K、PLC含量的檢測結(jié)果不同處理組之間心肌組織P13K含量差異有統(tǒng)計學(xué)意

13、義(F=10.976,P=0.000)。sham組中P13K.有少量表達。隨冠脈缺血時間的延長,心肌組織PI3K.含量呈逐漸增加趨勢。I60min組分別與sham組和I30min.組相比,PI3K含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為0.000、0.042)。
　　 不同處理組之間心肌組織PLC含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=7.275,P=0.001)。sham組中PLC有少量表達。隨冠脈缺血時間的延長,心肌組織PLC含量呈逐漸增加趨勢,

14、再灌注后有所下降。I60min組分別與sham組和I30min組相比,PLC含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為0.001、0.002)； IR組PLC含量與I60min相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.736)。
　　 第二部分
　　 (一)以培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶(LDH)含量判定心肌細胞損傷程度:
　　 缺氧培養(yǎng)對大鼠心肌細胞培養(yǎng)基中LDH漏出量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=10.892,P=0.000)。Control組培養(yǎng)

15、基中LDH含量較低。I60min組、IR組、LY-294002組和U-73122組培養(yǎng)基中LDH含量大大增加,與control組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均為0.000)。
　　 (二)心肌細胞存活率:
　　 不同處理組之間細胞存活率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=42.618,P=0.000)。Control組中心肌細胞存活率最高。I60min組和IR組細胞存活率下降,LY-294002組和U-73122組細胞存活率更低。I60m

16、in組、IR組、LY-294002組、U-73122組分別與control組相比細胞存活率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均為0.000),LY-294002組、U-73122組分別與I60min組相比細胞存活率差差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為0.016、0.002)。
　　 (三)單個心肌細胞收縮舒張功能:
　　 不同處理組之間心肌細胞收縮幅度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=15.893,P=0.000)。Control組中心肌細胞收縮幅度

17、最大。I60min組心肌細胞收縮幅度最低,較control組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。LY-294002組及U-73122組心肌細胞收縮幅度大大增加,與I60min組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為0.000、0.001)；LY-294002組與control組相比心肌細胞收縮幅度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.689)。
　　 (四)不同刺激對心肌細胞α—actinin熒光強度改變不同處理組之間心肌細胞α-actini

18、n熒光強度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=28.770,P=0.000)。Control組中心肌細胞α-actinin熒光強度最高,I60min組心肌細胞α-actinin熒光強度最低,較control組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)。應(yīng)用LY-294002及U-73122處理心肌細胞后α-actinin熒光強度較I60min組明顯升高(P值均為0.000),但仍低于control組(P值為0.000、0.001)。
　　 (五)

19、不同刺激對心肌細胞Ca2+-Mg2+-ATPase含量的影響不同處理組之間心肌細Ca2+-Mg2+-ATPase含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=14.668,P=0.000)。Control組中心肌細胞Ca2+-Mg2+-ATPase含量最高,I60min組心肌細胞ca2+-Mg2+-ATPase含量最低,與control組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。應(yīng)用LY-294002及U-73122處理心肌細胞后Ca2+-Mg2+-ATPa

20、se含量較I60min組高(P值均為0.000),但仍低于control組(P值為0.033、0.020)。
　　 根據(jù)以上實驗結(jié)果,本研究可以初步得出以下結(jié)論:
　　 1.在整體水平上,冠狀動脈缺血60 min可以引起心肌功能障礙和細胞骨架結(jié)構(gòu)破壞。
　　 2.冠狀動脈缺血后心肌細胞骨架蛋白α-actinin的變化可能是缺血引起心功能障礙的原因之一。
　　 3.冠狀動脈缺血后α-actinin的改變可能