再生障礙性貧血患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性及功能的系統(tǒng)研究.pdf

1、再生障礙性貧血(aplastic anemia, AA)是一種免疫介導(dǎo)的骨髓衰竭綜合征，是血液科常見病、多發(fā)病及難治性疾病，其顯著特點(diǎn)是骨髓造血衰竭。以往研究更多集中于造血干/祖細(xì)胞損傷機(jī)制方面，但因其數(shù)量顯著減少、功能缺陷、體外不易擴(kuò)增卻容易分化等缺點(diǎn)限制此方面研究，目前處于相對(duì)停滯狀態(tài)。尋找一種全新的研究方向勢(shì)在必行。而再生障礙性貧血患者骨髓脂肪化、血管新生能力降低、骨皮質(zhì)變薄等現(xiàn)象提示骨髓造血微環(huán)境同樣存在缺陷。因此，研究骨髓造血

2、微環(huán)境中各種細(xì)胞成分的前體細(xì)胞—骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchyrnal stem cells,BM-MSCs)的生物學(xué)特性及其功能具有重要意義。
　　 第一部分：
　　 目的:本研究旨在系統(tǒng)、全面地比較研究再生障礙性貧血患者BM-MSCs和正常人BM-MSCs生物學(xué)特性及功能的差異，為探討再生障礙性貧血BM-MSCs損傷機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及理論依據(jù)，亦為再生障礙性貧血的發(fā)病機(jī)制研究探討新思路。<

3、br>　　 方法:(1)采用貼壁、傳代培養(yǎng)的方法從AA患者和正常人骨髓組織中獲取相對(duì)純化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞:(2)倒置顯微鏡及共聚焦熒光顯微鏡觀察骨架蛋白p-tubulin染色后BM-MSCs的形態(tài)變化;(3)流式細(xì)胞儀檢測(cè)培養(yǎng)的BM-MSCs表面標(biāo)志:(4)定向誘導(dǎo)BM-MSCs向脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化，進(jìn)行相應(yīng)染色及分化標(biāo)志鑒定，比較成脂、成骨、成內(nèi)皮的分化潛能;(5)測(cè)定BM-MSCs成纖維細(xì)胞樣的集落形成能力(CFU

4、-F)及增殖曲線;(6)流式細(xì)胞儀方法檢測(cè)BM-MSCs細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡;(7)采用A你11etrix基因表達(dá)譜檢測(cè)方法比較分析AA患者與正常BM-MSCs基因表達(dá)譜間的差異;(8)磁珠分選臍血來源的CD34+細(xì)胞，建立BM-MSCs與CD34+細(xì)胞共培養(yǎng)的二種培養(yǎng)體系(LTC assay和MK assay)，比較研究AA患者和正常BM-MSCs擴(kuò)增CD34+細(xì)胞能力和促進(jìn)造血克隆( CFU-G,CFU-M, CFU-GM, CFU-

5、Mix, BFU-E和CFU-MK)形成的能力;同時(shí)比較了二種BM-MSCs表達(dá)造血生長(zhǎng)因子(SCF, IL-3, EPO, TPO, IL-11, G-CSF, M-CSF和GM-CSF)的異同。(9)磁珠分選健康人外周血CD4+細(xì)胞，同時(shí)采用貼壁法去除CD4-細(xì)胞中的貼壁細(xì)胞以獲得相對(duì)高比例的CD4'淋巴細(xì)胞(大多數(shù)為CD8+細(xì)胞)，建立BM-MSCs與CD4+/CD4-細(xì)胞共培養(yǎng)體系，比較研究BM-MSCs對(duì)CD4+/CD4"細(xì)胞

6、的克隆形成能力、增殖、分泌TNF-α和IFN-γ的影響，以及BM-MSCs促進(jìn)CD4+細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化能力。
　　 結(jié)果:(1)成功培養(yǎng)并獲取高純度的再生障礙性貧血患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;(2)AA患者BM-MSC:與正常BM-MSCs存在形態(tài)學(xué)差異，正常BM-MSCs細(xì)胞體積小、纖細(xì)、呈長(zhǎng)梭形，規(guī)則排列生長(zhǎng);AA患者BM-MSCs細(xì)胞體積較大，呈短梭形、多角形、不規(guī)則形，邊緣不整齊，部分細(xì)胞見雙核、多核。(3) AA患者B

7、M-MSCs除了更高表達(dá)CD90外，其余表達(dá)標(biāo)志CD73, CD105, CD90, CD44. CD29, CD49e.CD166以及MHC-I類分子HLA-ABC無顯著差別。二者均不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)志CD34, CD45及MHC-II類分子HLA-DR o(4) AA患者BM-MSCs更易向脂肪細(xì)胞分化，但分化為內(nèi)皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞能力弱于正常BM-MSCs o(5) AA患者BM-MSCs形成CFU-F的能力和增殖能力明顯弱于正常BM

8、-MSCsa(6) AA患者和正常人BM-MSCs90％以上均處于GO/Gl期，但AA患者BM-MSCs細(xì)胞凋亡水平明顯增加。(7) A如netrix基因表達(dá)譜檢測(cè)結(jié)果顯示，AA患者和正常人BM-MSCs間存在差異表達(dá)的基因多達(dá)314個(gè)(Fold change>_2倍)，涉及造血調(diào)控、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞粘附、成脂分化等多方面基因。(8)與臍血來源的CD34+細(xì)胞共培養(yǎng)結(jié)果顯示，AA患者BM-MSCs擴(kuò)增CD34+細(xì)胞能力

9、和促進(jìn)造血克隆形成能力(尤其支持長(zhǎng)期造血能力和巨核細(xì)胞系造血能力)減弱。另外，二種BM-MSCs均不表達(dá)IL-3和EPO AA患者BM-MSCs表達(dá)SCF. TPO. IL-11 mRNA水平低于正常者，而表達(dá)G-CSF和GM-CSF mRNA水平高于正常者，M-CSF差異不顯著。(9)與外周血來源的CD4+/CD4-細(xì)胞共培養(yǎng)結(jié)果顯示，AA患者BM-MSCs抑制CD4+/CD4-細(xì)胞克隆形成、增殖和分泌TNF-α/IFN-γ的能力存在

10、缺陷、促進(jìn)CD4+細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化能力減弱。
　　 結(jié)論:(I)再生障礙性貧血患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞存在多方面、多層次的缺陷。(2)再生障礙性貧血患者BM-MSCs的多種生物學(xué)特性異常，包括形態(tài)異常、增殖和CFU-F形成能力減弱、多向分化能力異常(易成脂，不易向成骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞方向分化)、細(xì)胞凋亡增加、基因表達(dá)譜異常。(3)再生障礙性貧血患者BM-MSCs通過分化為成骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成HSC完的能力減弱。(4)再生障礙性

11、貧血患者BM-MSCs支持造血能力(尤其支持長(zhǎng)期造血能力和巨核細(xì)胞系造血能力)減弱。(5)再生障礙性貧血患者BM-MSCs抑制CD4+/CD4-細(xì)胞增殖和分泌TNF-α/IFN-γ能力缺陷、促進(jìn)CD4+細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化能力減弱。
　　 背景:再生障礙性貧血是一種免疫介導(dǎo)的骨髓衰竭性疾病，其發(fā)病機(jī)制涉及大量異常的免疫細(xì)胞和免疫分子。其中，IFN-γ, TNF-α和多種白細(xì)胞介素(Ils)發(fā)揮著主要作用。IL-27是近年發(fā)現(xiàn)的

12、一種IL-6/IL-12細(xì)胞因子家族成員，在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮著促進(jìn)和抑制炎癥的雙重作用。IL-27可以誘導(dǎo)Thl細(xì)胞極化，促進(jìn)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ。然而，目前尚無IL-27在再生障礙性貧血發(fā)病機(jī)制中的相關(guān)報(bào)道。
　　 第二部分：
　　 目的:本研究旨在檢測(cè)再生障礙性貧血患者骨髓中IL-27及其受體的表達(dá)水平，探討其在再生障礙性貧血發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　 方法:(1)采用Ficoll密度梯度離心法分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞(

13、BMMNC);(2) Real-timeI'CR方法檢測(cè)BMMNC中IL-27(p28和EBI3)及其受體(WSX-1/TCCR和gp130)mRNA表達(dá)水平:(3)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IL-27刺激前后骨髓CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞內(nèi)IFN-γ, TNF-α的表達(dá)水平:(4) ELISA方法檢測(cè)骨髓上清中IL-27, IFN-γ和TNF-α的水平以及IL-27刺激前后BMMNC培養(yǎng)上清中IFN-γ和TNF-α的水平變化。
　　 結(jié)

14、果:(1)再生障礙性貧血患者骨髓BMMNC中IL-27(p28和EBI3)和IL-27R的亞單位gp130 mRNA表達(dá)水平高于正常對(duì)照組(P<0.05)，WSX-1lTCCR的表達(dá)水平雖然高于正常對(duì)照，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(2)再生障礙性貧血患者骨髓上清中IL-27的濃度均高于正常對(duì)照(P<0.05)，且與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。(3)再生障礙性貧血患者骨髓上清中IFN-γ和TNF-α的濃度和CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞內(nèi)

15、IFN-γ和TNF-α的表達(dá)水平均高于正常對(duì)照，除了CD8+ T淋巴細(xì)胞內(nèi)IFN-γ的表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余均具有顯著性差異(P<0.05) o(4) rhIL-27促進(jìn)正常對(duì)照和再生障礙性貧血患者骨髓CD4+和CD8+ T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生更多的TNF-α和IFN-γ(P<0.05)。(5) rhIL-27促進(jìn)再生障礙性貧血患者BMMNC產(chǎn)生更多的TNF-α和IFN-γ(P<0.05)。
　　 結(jié)論:再生障礙性貧血患者骨髓中增