轉錄因子Fur直接調控鴨疫里氏桿菌毒力的研究.pdf

1、鴨疫里氏桿菌病是由鴨疫里氏桿菌(Riemerella anatipestifer，RA)引起的家鴨、鵝、火雞和多種禽類的一種細菌性傳染病，臨床剖檢癥狀主要為全身漿膜的炎性滲出。本病在世界廣泛分布，感染引起高發(fā)病率和死亡率，為我國法定的二類動物疫病。RA血清型眾多且復雜，各血清型之間交叉保護性低，給該病的防治帶來諸多困難。而且本病一旦發(fā)生很難徹底清除，主要以藥物防治為主。因此加強RA的致病機制的研究，對從根本上預防該病的發(fā)生具有重要意義。

2、
　　鐵是細菌生長和繁殖的關鍵性元素，廣泛存在于細菌代謝途徑中。但是過量的鐵容易引起芬頓反應產生羥自由基進而對細胞產生毒害反應。鐵攝取調節(jié)蛋白(ferric uptake regulator，Fur)不僅調控細菌鐵的穩(wěn)態(tài)，并且能夠與其它調控系統(tǒng)協(xié)同作用，直接或間接調控細菌的生長、代謝和毒力。但是Fur在RA中的作用尚不清楚?；蛉笔羌毦肿由飳W研究的基本工具，但目前還沒有關于RA無抗性基因缺失株方法的報道。因此，本研究首先利用

3、苯丙氨酸-tRNA合成酶pheS和lacZ，構建了RA-YM株fur基因無抗性缺失突變株。以野生型質粒pRA-JX為基礎，構建了穿梭質粒pRES-JX-spc，利用該質粒構建回復株C△fur。通過動物實驗驗證Fur與RA的毒力有關。利用轉錄組測序技術，篩選了鴨疫里氏桿菌基因組中受鐵調控基因和受Fur調控基因，對Fur調節(jié)RA的毒力機制進行研究。具體內容如下:
　　1.鴨疫里氏桿菌fur基因無抗性基因缺失突變株△fur及回復株C△f

4、ur的構建與鑒定
　　本文首先構建了用于RA無抗性基因缺失突變株的自殺性質粒pRE-lacZ-mpheS-spc和回復株的穿梭質粒pRES-JX-spc。利用生長抑制試驗發(fā)現RA對0.2％對氯苯丙氨酸敏感，證實pheS可以做為負篩選標記。通過對PheS301位氨基酸由丙氨酸突變?yōu)楦拾彼?，其它進行無義突變，野生型核苷酸序列與突變型核苷酸序列同源性71％，減少在該位點發(fā)生同源重組的概率。將突變型pheS與RA的rpsL基因啟動子融合構

5、建mpheS表達盒?？寺acZ基因，與rpsL啟動子融合，利用X-gal通過顏色可以直觀的鑒定同源重組是否完成。以pRE112質粒為基礎，結合抗性基因spc，負篩選標記pheS和指示標記lacZ連接構建自殺性質粒pRE-lacZ-mpheS-spc。克隆pRA-JX質粒的復制區(qū)域，構建穿梭質粒pRES-JX-spc，利用該質?？梢詷嫿ǚ€(wěn)定遺傳的回復突變菌株。
　　構建了RA-YM△fur無抗性基因缺失突變株和回復株C△fur。克

6、隆fur基因的左、右同源臂，利用重疊PCR將左右同源臂融合，通過酶切的方法并連接至自殺性質粒pRE-lacZ-mpheS-spc。以含有自殺性質粒pRE-lacZ-mpheS-spc-fur的E.coli X7213為供體菌，以RA-YM株為受體菌，通過兩步同源重組法篩選得到RA-YM△fur無抗性基因缺失突變株。第一步首先利用篩選標記spc篩選雜合體菌株，第二步利用篩選標記pheS和lacZ篩選無抗性基因缺失株?？寺ur基因啟動子和

7、編碼區(qū)序列，利用重疊PCR融合fur基因啟動子和編碼區(qū)，通過酶切的方法連接到穿梭質粒pRES-JX-spc。以含有重組穿梭質粒pRES-JX-spc-fur的E.coli X7213為供體菌，以RA-YM△fur為受體菌，利用篩選標記spc篩選回復株C△fur。
　　通過感染雛鴨測定RA-YM△fur的致病性。動物試驗結果顯示野生株RA-YM、基因缺失突變株RA-YM△fur和回復突株C△fur的LD50分別為2.0×106CFU

8、，1.6×108CFU和1.2×107CFU。RA-YM△fur基因缺失突變株的毒力較野生株RA-YM毒力下降約80倍，回復株C△fur的毒力較RA-YM△fur毒力有所回升。對野生株RA-YM和RA-YM△fur基因缺失突變株的血液和組織載菌量進行比較，結果顯示RA-YM△fur基因缺失突變株的載菌量均較野生株RA-YM低。另外組織剖檢和病理切片觀察，RA-YM△fur基因缺失突變株引起的組織病變較野生株RA-YM輕微。證實fur基因

9、與RA-YM株的毒力有關。
　　2.轉錄因子Fur的轉錄調控基因的研究
　　通過對RA-YM菌株和RA-YM△fur菌株在限鐵和富鐵情況下的轉錄組進行比較，從全基因組水平上篩選受鐵調控基因和受Fur調控基因。并隨機挑選4個受鐵調控的基因和4個受Fur調控的基因，利用熒光定量PCR對轉錄組測序結果進行驗證，結果顯示熒光定量PCR結果與轉錄組測序結果相符。轉錄組測序結果篩選出70個受鐵調控基因和17個受Fur調控基因。轉錄組測序

10、具體結果如下:
　　限鐵條件下，鐵調控的基因中有45個基因表達上調。其中7個與細菌的鐵運輸和儲存有關，6個與細菌的固氮過程有關，5個與氨基酸和輔酶的合成有關，5個與細胞表面結構與修飾有關，2個與嘌呤和核苷酸的合成有關;其余的與大分子的合成、轉錄調控功能以及未知功能等有關。限鐵條件下，鐵調控的基因中有25個基因表達下調。其中6個與三羧酸循環(huán)有關，7個與氧化應激有關，其余與細胞的轉運功能以及未知功能等有關。
　　Fur直接調控的

11、基因有17個，其中5個參與鐵的獲取，2個參與氧化應激，1個為Ⅸ型分泌系統(tǒng)元件，其余參與氨基酸的合成和未知功能等。另外對Fur直接調控的基因啟動子序列分析，預測得到Fur結合位點的序列為5'-ATTTAGAATTATTCTAAAT-3'。
　　利用pET28a-fur質粒對Fur蛋白進行原核表達。擴增fur基因的編碼區(qū)，通過酶切構建pET28a-fur質粒，并轉化E.coil BL21(DE3)感受態(tài)細胞。利用IPTG誘導表達并利用

12、His標簽純化柱純化Fur蛋白。隨機選擇4個受Fur調控的基因，利用生物素標記的引物擴增其啟動子序列，利用原核表達的Fur蛋白，通過凝膠遷移實驗驗證Fur蛋白與啟動子的互作，結果顯示Fur蛋白在體外可以與調控基因的啟動子序列結合。
　　綜上所述，本試驗成功的構建了基于苯丙氨酸-tRNA合成酶pheS和lacZ為篩選標記的無抗性基因缺失株方法，構建了fur基因缺失株RA-YM△fur。構建了穿梭質粒pRES-JX-spc，利用該質粒