甘露聚糖結(jié)合凝集素(MBL)阻遏人巨細(xì)胞病毒感染MD-DC細(xì)胞的研究.pdf

1、人巨細(xì)胞病毒(HCMV)是一種229kb的雙鏈DNA染色體的皰疹病毒科病毒，HCMV感染是兒童常見的感染性疾病。由于HCMV產(chǎn)生的病毒因子逃逸宿主免疫，機(jī)體無法徹底清除病毒。目前研究表明，HCMV的復(fù)制和感染需要依賴其病毒的包膜糖蛋白，后者在識(shí)別宿主細(xì)胞膜受體、吸附和穿入宿主細(xì)胞、病毒的致病力以及誘導(dǎo)宿主反應(yīng)等方面起重要作用。HCMV病毒感染細(xì)胞的過程是從病毒包膜糖蛋白與靶細(xì)胞膜表面受體結(jié)合開始的，結(jié)合后HCMV以膜融合或受體介導(dǎo)的內(nèi)吞

2、機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞。因此，阻遏HCMV糖蛋白與靶細(xì)胞膜的結(jié)合是控制HCMV感染的重要切入點(diǎn)。
　　 DC細(xì)胞表面的特異性細(xì)胞間黏附因子3結(jié)合非整合素分子(dendritic cell-specific ICAM-3-grabbing nonintegrin，DC-SIGN)是一種帶有外部甘露糖結(jié)合位點(diǎn)的C型凝集素結(jié)構(gòu)域的Ⅱ型膜蛋白，能識(shí)別多種病原體如病毒、細(xì)菌、蠕蟲和真菌，在DC細(xì)胞識(shí)別模式中起重要作用。
　　 天然免疫分子甘

3、露(聚)糖結(jié)合凝集素(mannose-binding lectin，MBL)系C型凝集素超家族成員之一，可與病毒表面多種糖基高效結(jié)合組成了機(jī)體抗病毒的第一道防線且參與感染進(jìn)程的調(diào)控。目前未見將MBL應(yīng)用于HCMV感染的研究報(bào)道。
　　 本研究研制和純化重組MBL(rMBL)，從人血漿中純化出天然MBL(hMBL)，從人外周血單個(gè)核細(xì)胞中分離培養(yǎng)出高表達(dá)DC-SIGN的DC細(xì)胞(monocyte-derived dendritic

4、 cell，MD-DC)；研究不同濃度的hMBL/rMBL在阻遏MD-DC捕獲HCMV，和阻遏HCMV在MD-DC間擴(kuò)散的功能上的作用差異及時(shí)間點(diǎn)，并初步探討其機(jī)制。
　　 方法
　　 1、構(gòu)建表達(dá)人野生型MBL的中國(guó)倉鼠卵巢細(xì)胞
　　 構(gòu)建含野生型MBL的pNOW/CMV-A表達(dá)載體，參照Ohtanietal方法并加以改進(jìn)。用上述載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞株，按Transfast說明書配制轉(zhuǎn)染試劑并進(jìn)行轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的CHO

5、細(xì)胞，用G418篩選抗性細(xì)胞即穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，熒光定量PCR分析穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株MBL基因的表達(dá)，用ELISA法檢測(cè)MBL蛋白濃度。
　　 2、rMBL和hMBL的純化，定量和SDS-PAGE鑒定純度
　　 CHO/MBL細(xì)胞在含20％小牛血清的MEDM培養(yǎng)液中，37℃，5％CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。取培養(yǎng)上清和人新鮮血漿進(jìn)行甘露聚糖-Sepharose4B親和層析純化。SDS-PAGE鑒定純度，考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行蛋白定量。

6、
　　 3、MD-DC細(xì)胞的獲得
　　 MD-DC是從人外周血濃縮單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)分離培養(yǎng)而來，rhGM-CSF和rhIL-4刺激培養(yǎng)，第3天半量更換含細(xì)胞因子的培養(yǎng)液，第6天收獲細(xì)胞。
　　 4、MBL阻遏MD-DC細(xì)胞捕獲HCMV功能
　　 取新收獲的，培養(yǎng)第6天的克隆增長(zhǎng)的MD-DC，用不同濃度的hMBL/rMBL預(yù)處理DC細(xì)胞半小時(shí)后，再以HCMV感染MD-DC細(xì)胞2小時(shí)，熒光定量PCR檢測(cè)

7、MD-DC內(nèi)HCMV-DNA拷貝數(shù)。MD-DC捕獲HCMV-DNA拷貝數(shù)的百分?jǐn)?shù)(％)=捕獲的HCMV-DNA拷貝數(shù)/初始加入的HCMV-DNA拷貝數(shù)×100。結(jié)果經(jīng)SPSS軟件16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MD-DC內(nèi)HCMV-PP65陽性率(PP65為HCMV的一種特異蛋白，＞2％為陽性，＜0.5％為陰性，0.5％～2％為可疑陽性)。用PKH26紅色熒光標(biāo)記HCMV，用CD209-FITC綠色標(biāo)記MD-DC細(xì)胞表面的DC-SIG

8、N。通過激光共聚焦直接觀察DC-SIGN對(duì)HCMV的捕獲情況，用“imaginj”軟件定量分析單位細(xì)胞面積內(nèi)的病毒量，結(jié)果經(jīng)SPSS軟件16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 5、MBL阻遏HCMV在MD-DC細(xì)胞間擴(kuò)散
　　 取新收獲的，培養(yǎng)第6天的克隆增長(zhǎng)的MD-DC，經(jīng)HCMV感染2小時(shí)后，將MD-DC和不同濃度的hMBL/rMBL共培養(yǎng)3天，在第24小時(shí)、第48小時(shí)，第72小時(shí)用經(jīng)熒光定量PCR檢測(cè)MD-DC內(nèi)HCMV-DN

9、A拷貝數(shù)。MD-DC內(nèi)HCMV-DNA拷貝數(shù)的百分?jǐn)?shù)(％)=MD-DC內(nèi)HCMV-DNA拷貝數(shù)/初始加入的HCMV-DNA拷貝數(shù)×100。結(jié)果經(jīng)SPSS軟件16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。在第72小時(shí)用流式細(xì)胞術(shù)比較MD-DC內(nèi)HCMV-PP65蛋白陽性率，明確MBL阻遏HCMV在MD-DC間擴(kuò)散的功能。
　　 結(jié)果：
　　 1、穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞目的基因表達(dá)效果檢測(cè)結(jié)果：RT-Q-PCR技術(shù)，檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞目的基因表達(dá)效果，篩選得到穩(wěn)定細(xì)胞株

10、中，CHO-MBL目的基因表達(dá)是轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞株的103倍以上。
　　 2、純化到大量的NMBL/rMBL：在800ml的CHO/MBL培養(yǎng)上清中，能純化到447.86ugrMBL；從200ml人血漿中純化出420.92ughMBL。純化蛋白電泳：血漿MBL還原電泳可見26KD和32KD兩種單體、52KD二聚體、78KD三聚體；血漿MBL非還原電泳均為＞170KD之多聚體；重組MBL還原電泳，可見32KD單體；重組MBL非還原電

11、泳：均為＞170KD之多聚體。
　　 3、MD-DC的培養(yǎng)：人外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)rhGM-CSF和rhIL-4刺激后，第6天收集MD-DC。光鏡下觀察MD-DC形態(tài)：可見細(xì)胞成簇懸浮生長(zhǎng)，形態(tài)不規(guī)則，可見偽足。電鏡下MD-DC形態(tài)具有典型的樹突樣特征。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)到表達(dá)DC的特征性標(biāo)志：MHC-Ⅱ、CD80、CD86、CD40。用抗DC-SIGN的單克隆抗體CD209-FITC流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC-SIGN百分?jǐn)?shù)達(dá)88％。

12、r>　　 4、不同濃度的hMBL/rMBL阻遏MD-DC捕獲HCMV的作用
　　 熒光定量PCR法檢測(cè)MD-DC內(nèi)HCMV-DNA的拷貝數(shù)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，與對(duì)照組相比，1μg/ml的hMBL組和1μg/mlrMBL組均無顯著性差異，而5μg/ml和10μg/ml的hMBL組，5μg/ml和10μg/mlrMBL組均具有顯著性差異。各種濃度的hMBL組和rMBL組兩兩比較均值均偏低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。流式細(xì)胞儀檢測(cè)MD-DC內(nèi)

13、HCMV-PP65的陽性率，陰性對(duì)照組為陽性，10μg/ml濃度的hMBL/rMBL組均為可疑陽性。激光共聚焦技術(shù)下經(jīng)定量檢測(cè)單位細(xì)胞面積內(nèi)的病毒量，10μg/ml濃度的hMBL/rhMBL具有明顯的阻遏MD-DC捕獲HCMV的作用。
　　 5、不同濃度的hMBL/rMBL阻遏HCMV在MD-DC間擴(kuò)散的功能結(jié)果
　　 經(jīng)HCMV感染后的MD-DC和不同濃度的hMBL/rMBL共培養(yǎng)3天，結(jié)果經(jīng)熒光定量PCR檢測(cè)，與對(duì)照

14、組相比，在共培養(yǎng)的第24小時(shí)和第48小時(shí)各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比均無顯著差異。而在共培養(yǎng)第72小時(shí)檢測(cè)時(shí)，1μg/ml的hMBL/rMBL組和對(duì)照組相比，結(jié)果無顯著性差異。5μg/ml和10μg/ml的hMBL/rMBL組與對(duì)照組相比均有顯著性差異。各種濃度的hMBL組和rMBL組兩兩比較均值均偏低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在第72小時(shí)用流式細(xì)胞術(shù)比較細(xì)胞內(nèi)HCMVPP65蛋白陽性率，10μg/ml的hMBL/rMBL孵育組也明顯低于對(duì)照組。<