p65-miR-23a~27a~24調(diào)節(jié)異常在紅系分化障礙中作用的研究.pdf

1、MicroRNA(miRNA)在人體發(fā)育、腫瘤發(fā)生、細(xì)胞增殖和凋亡過程中發(fā)揮重要作用。MiR-23a～27a～24基因簇(miR-23a～27a～24cluster，miR-cluster)定位于染色體19p13，其編碼的pri-miRNA轉(zhuǎn)錄本經(jīng)剪切后形成miR-23a、miR-27a及miR-24三種miRNA。
　　課題組前期研究證實(shí)miR-24通過抑制紅系特異蛋白—帶3蛋白的表達(dá)阻礙紅白血病細(xì)胞系K562分化。本研究在此基

2、礎(chǔ)上進(jìn)一步探討miR-cluster在紅系分化障礙過程中的作用。我們克隆了區(qū)間范圍為nt-2425～nt-94的一段序列（以pre-miR-24-2第一個(gè)堿基為+1），該序列包含了文獻(xiàn)報(bào)道的miR-23a～27a～24的啟動(dòng)子核心區(qū)域;生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子NF-κBp65(p65)在該序列的nt-243～nt-235區(qū)域有作用位點(diǎn)，相關(guān)分子實(shí)驗(yàn)證明p65直接與該序列結(jié)合，上調(diào)該序列的熒光素酶報(bào)告基因活性，并促進(jìn)三種miRNA的表達(dá)，而

3、三種miRNA可以抑制p65的表達(dá)，從而建立p65/miR-23a～27a～24的負(fù)反饋調(diào)節(jié)關(guān)系。我們還發(fā)現(xiàn)，在定向紅細(xì)胞分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)C57BL/6小鼠骨髓來源細(xì)胞（培養(yǎng)第9、10天出現(xiàn)成熟紅細(xì)胞）3天，p65及磷酸化p65(p-p65)急劇升高，而后快速下降，這一過程與miR-cluster呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的動(dòng)態(tài)變化，提示了p65/miR-23a～27a～24負(fù)反饋調(diào)節(jié)參與紅細(xì)胞成熟的過程。培養(yǎng)紅白血病細(xì)胞系K562于pH7.6或含有促

4、紅細(xì)胞生成素（Erythropoietin，EPO）的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化，檢測(cè)分化后p65、p-p65和三種miRNA的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)分化后細(xì)胞中p65和三種miRNA水平均顯著下降，提示K562細(xì)胞可能被阻滯在相當(dāng)于體外培養(yǎng)的第5天階段，高水平的p65和p-p65是其分化障礙的原因;干擾p65表達(dá)時(shí)，K562細(xì)胞分化;p65抑制劑(Parthenolide，PN)或三種miRNA抑制劑(inhibitors)均能夠顯著促進(jìn)K

5、562細(xì)胞分化。在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，PN能夠顯著延長(zhǎng)紅白血病小鼠的存活時(shí)間，抑制轉(zhuǎn)移。
　　此外，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)26種紅系分化相關(guān)蛋白是三種miRNA的作用靶點(diǎn)。以帶3蛋白，帶4.1蛋白R(shí)，血型糖蛋白A與p16作為研究對(duì)象，證明三種miRNA能夠明顯下調(diào)四種蛋白的表達(dá)。提示p65在紅系分化中的作用是通過三種miRNA調(diào)控紅系相關(guān)蛋白來實(shí)現(xiàn)。
　　綜上所述，我們的研究證明了p65/miR-23a～27a～24負(fù)反饋調(diào)節(jié)是