整合多組學(xué)數(shù)據(jù)解析miRNA在大麥鹽脅迫響應(yīng)和籽粒發(fā)育過程中的作用.pdf

1、microRNA(miRNA)是一類非編碼小RNA分子，其以堿基互補(bǔ)配對方式與基因mRNA結(jié)合，介導(dǎo)靶基因降解或抑制翻譯，進(jìn)而參與基因表達(dá)調(diào)控，在植物生長、發(fā)育、逆境響應(yīng)等過程中起著重要作用。大麥(Hordeum vulgare)是世界上第四大禾本科作物，同時(shí)也是最耐鹽的作物之一，廣泛種植于干旱、半干旱地區(qū)，應(yīng)用于人類食物、動物飼料和啤酒釀造。隨著新一代高通量測序技術(shù)的發(fā)展和相關(guān)生物信息學(xué)分析手段的提高，整合多組學(xué)數(shù)據(jù)（如小RNA測序、

2、轉(zhuǎn)錄組、降解組等）為解析miRNA在大麥生長發(fā)育及逆境響應(yīng)過程中的作用帶來了新的機(jī)遇。本研究采用多組學(xué)數(shù)據(jù)相結(jié)合的策略，一方面，比較分析大麥鹽脅迫響應(yīng)及籽粒發(fā)育過程中的關(guān)鍵miRNAs及其調(diào)控靶基因，另一方面，系統(tǒng)分析野生大麥miRNAs，從miRNA角度比較分析野生大麥和栽培大麥間異同。本研究結(jié)果可豐富大麥miRNA數(shù)據(jù)，并揭示miRNA在大麥逆境響應(yīng)、生長發(fā)育及進(jìn)化過程中的作用。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)大麥鹽脅迫相關(guān)mi

3、RNA的鑒定與功能分析
　　我們以大麥栽培品種Morex為研究材料，取鹽脅迫(100 mM)處理后3h、8h和27h及相應(yīng)對照組樣品，分別構(gòu)建6個(gè)小RNA文庫和1個(gè)降解組測序文庫，然后，利用IlluminaHiseq2000測序平臺進(jìn)行高通量測序。數(shù)據(jù)分析共鑒定到152個(gè)miRNAs，包括28個(gè)大麥known miRNAs、114個(gè)同源miRNAs和10個(gè)novel miRNAs，隸屬于126個(gè)miRNAs家族。其中，44個(gè)miR

4、NAs在鹽脅迫條件下顯著差異表達(dá)，隸屬于39個(gè)miRNA家族，并且分別有14、4和11個(gè)miRNA家族為植物保守性、禾本科保守性和大麥鹽脅迫特異性表達(dá)。與對照組相比，絕大部分鹽脅迫響應(yīng)相關(guān)miRNAs在鹽脅迫處理8h后表現(xiàn)為顯著上調(diào)表達(dá)，而在3h和27h時(shí)表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)。隨后，結(jié)合降解組測序和生物信息學(xué)，我們對所有鹽脅迫相關(guān)miRNAs靶基因進(jìn)行系統(tǒng)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分別有86和37個(gè)參與新陳代謝和逆境響應(yīng)相關(guān)基因受到大麥鹽脅迫響應(yīng)相關(guān)mi

5、RNAs的調(diào)控，這些基因在鹽脅迫條件下主要表現(xiàn)為抑制植物生長和降低代謝活動。最后，我們利用qRT-PCR對部分miRNAs及其靶基因表達(dá)模式進(jìn)行比較分析。綜上所述，至少有39個(gè)miRNA家族及其調(diào)控的123個(gè)靶基因參與大麥苗期早期鹽脅迫響應(yīng)，這些結(jié)果可為進(jìn)一步解析大麥耐鹽機(jī)制提供參考。
　　(2)利用高通量測序技術(shù)鑒定野生大麥miRNAs及其靶基因
　　野生大麥?zhǔn)窃耘啻篼湹淖嫦确N，其也是大麥遺傳改良的重要基因庫。在本研究中，

6、我們選用野生大麥Mt Gilboa barley3-25為材料，分別提取其不同發(fā)育階段根、莖、葉和穗等組織的總RNA，然后等量混合RNA并構(gòu)建小RNA文庫。高通量測序共獲得9885815條clean reads，經(jīng)過數(shù)據(jù)分析，最終鑒定到55個(gè)known miRNAs、14個(gè)novelvariants和18個(gè)novel miRNAs。序列分析發(fā)現(xiàn)，本研究鑒定到的所有野生大麥miRNAs在4個(gè)大麥栽培品種中均具有高度保守性前體序列，尤其是在

7、成熟miRNA區(qū)間，表明miRNAs功能上的重要性決定其在大麥不同品系間高度保守。隨后，我們比較分析了14個(gè)novel variants和18個(gè)novel miRNAs在栽培大麥中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)21個(gè)miRNAs在栽培大麥morex中表達(dá)，包括7個(gè)novel variants和14個(gè)novel miRNAs，并且絕大部分表達(dá)miRNAs在栽培大麥和野生大麥間顯著差異表達(dá)(95.24％，20/21)，表明栽培大麥和野生大麥間表型變異

8、可能大部分來源于miRNAs的差異表達(dá)，而非基因組miRNAs組成。靶基因分析發(fā)現(xiàn)，有12個(gè)miRNA家族介導(dǎo)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，包括8個(gè)植物保守性和4個(gè)wheat-barley保守性miRNA家族。此外，其它靶基因主要參與各種生理、代謝及逆境響應(yīng)等過程。本研究首次在野生大麥中分析miRNAs，可為解析miRNAs在野生大麥中的調(diào)控作用提供參考。
　　(3)整合mRNA和小RNA表達(dá)分析解析大麥籽粒發(fā)育
　　大麥?zhǔn)茄芯亢瘫究谱魑镒?/p>

9、粒發(fā)育的重要模式材料，在本研究中，我們結(jié)合轉(zhuǎn)錄組和小RNA高通量測序，比較分析大麥籽粒發(fā)育過程中基因和小RNAs的動態(tài)表達(dá)變化，包括籽粒發(fā)育4個(gè)重要階段:早期物質(zhì)存儲前期準(zhǔn)備階段(stage01:0-5 DPA，開花后0-5天)，晚期物質(zhì)存儲前期準(zhǔn)備階段或過渡階段(stage02:6-10 DPA)、早期物質(zhì)存儲階段(stage03:11-15 DPA)和levels off階段(stage04:16-20 DPA)。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)

10、，在大麥籽粒發(fā)育過程中，初級和次級代謝相關(guān)基因表達(dá)活性均發(fā)生了顯著變化，并且轉(zhuǎn)錄活性變化與生理變化相一致，即隨著大麥籽粒的成熟，基因表達(dá)活性逐漸降低，變化最劇烈的時(shí)間出現(xiàn)在晚期物質(zhì)存儲前期準(zhǔn)備階段(stage02)向早期物質(zhì)存儲階段(stage03)過渡時(shí)，并且ABA和糖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在階段轉(zhuǎn)換中起著重要作用。另外，籽粒自身光合作用相關(guān)基因表達(dá)最活躍時(shí)期出現(xiàn)在stage01和stage02，且主要參與脂肪代謝和核苷酸代謝，而非碳水化合物合成。

11、整合小RNAs數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，絕大部分miRNAs表達(dá)最活躍時(shí)期出現(xiàn)在基因表達(dá)最不活躍(stage04)和最活躍時(shí)期(stage01)，而siRNAs主要在基因最不活躍時(shí)期(stage03和stage04)表達(dá)活性最高，表明在大麥籽粒發(fā)育過程中，miRNAs可能主要扮演著“regulator”的角色，其通過介導(dǎo)基因表達(dá)調(diào)控參與各種新陳代謝過程，而siRNAs主要扮演著“silencer”的角色，主要負(fù)責(zé)抑制基因活性，直至種子休眠。此外，我