力生長因子E肽對體外骨形成與骨吸收的調(diào)控機制研究.pdf

1、胰島素樣生長因子I(IGFI)是含有70個氨基酸的單鏈多肽,為骨基質(zhì)中含量最豐富的生長因子,對骨代謝有著重要的調(diào)節(jié)作用。IGFI的E結(jié)構(gòu)域發(fā)生選擇性剪接產(chǎn)生3種異構(gòu)體:IGFIEa,IGFIEb(大鼠)和IGFIEc(人類)。其中IGFIEb和IGFIEc一般在肌肉或成骨細胞受到機械刺激或損傷時才得以表達,因此也稱作力生長因子(mechano-growth factor,MGF)。分子結(jié)構(gòu)表征發(fā)現(xiàn)MGF羧基端E結(jié)構(gòu)域含有24個氨基酸組成

2、的短肽(也稱MGF-Ct24E),正是由于MGF-Ct24E才導致MGF功能上與IGFI和IGFIEa不同。MGF自1996年被Goldspink研究團隊發(fā)現(xiàn)以來,許多研究證實MGF是一種重要的局部組織修復因子。當機體受到機械刺激或組織受損后,MGF得以表達并誘導體內(nèi)衛(wèi)星細胞增殖和分化。MGF-Ct24E與MGF功能相似,也具有誘導成肌細胞增殖和神經(jīng)保護作用,提示 MGF-Ct24E一旦從MGF分離出來,其本身固有的生物活性如組織保護、

3、修復和適應等將得以發(fā)揮。我們前期研究發(fā)現(xiàn)MGF以自分泌或旁分泌的方式積極響應骨細胞(或組織)損傷修復,在兔骨折模型中MGF-Ct24E通過促進成骨細胞增殖和血管新生加速骨折愈合?；诒菊n題組對MGF-Ct24E的前期研究成果,本研究試圖從細胞水平和分子水平探索MGF-Ct24E對骨形成與骨吸收的影響,以便于尋求確切的靶基因和信息通路,為其將來臨床應用于骨修復提供可能。主要研究內(nèi)容包括
　?、錗GF-Ct24E對成骨細胞的功能調(diào)控及

4、轉(zhuǎn)錄組分析：①通過檢測MGF-Ct24E對新生大鼠顱骨成骨細胞增殖、周期、分化及礦化的影響,結(jié)果表明MGF-Ct24E促進早期成骨細胞增殖延遲終末分化,促進晚期成骨細胞分化和礦化,最終促進骨形成。②利用基因芯片檢測MGF-Ct24E對成骨細胞骨形成過程中基因表達的影響,結(jié)果表明 MGF-Ct24E能有效調(diào)節(jié)成骨細胞基因的表達,差異表達基因總共2054個,其中上調(diào)1179個,下調(diào)基因875個;qPCR檢測結(jié)果顯示,所選擇的12個差異表達基

5、因(IL1RN、FIGF、CXCL12、ZW10、NOTHCH2、TWIST2、ALPL、IGFBF5、FGFR2、COMP、COL2A1和 IGFI)的差異表達情況與基因芯片實驗結(jié)果基本一致,驗證了基因芯片實驗結(jié)果的可靠性。③應用GoSurfer軟件和在線軟件DAVID對MGF-Ct24E調(diào)控成骨細胞差異表達的基因進行 GO分析,發(fā)現(xiàn)富集指數(shù)最高的差異表達基因定位于細胞內(nèi)部、具有酶結(jié)合功能、參與細胞周期進程。Pathway分析發(fā)現(xiàn)這些

6、差異表達基因主要參與調(diào)控粘著斑通路、細胞周期通路、肌動蛋白細胞骨架調(diào)控通路、縫隙連接通路、MAPK信號通路、黏著連接通路和胰島素信號通路等67個信號通路。④對差異表達基因GO生物學過程第3~8層次的節(jié)點和Term進行仔細篩選,總共得到95個成骨細胞相關(guān)基因。GO生物學過程分析發(fā)現(xiàn),這些基因主要富集的功能分類包括成細胞周期、骨細胞分化負調(diào)控、骨化負調(diào)控、軟骨骨化、骨化調(diào)控、骨發(fā)育、骨化、骨礦化、血管生成、成骨細胞分化、骨骼系統(tǒng)發(fā)育、細胞正

7、在調(diào)控、細胞增殖、創(chuàng)傷反應等。Pathway分析發(fā)現(xiàn)它們主要參與調(diào)控黏著斑、肌動蛋白細胞骨架調(diào)控通路、細胞外基質(zhì)受體作用通路、細胞因子及其受體的相互作用通路、MAPK信號通路、黏著連接通路、TGF-β信號通路、白細胞跨內(nèi)皮遷移信號通路和Wnt信號通路等多9個通路。
　?、鍹GF-Ct24E對破骨細胞的功能調(diào)控及轉(zhuǎn)錄組分析：①通過檢測MGF-Ct24E對破骨細胞增殖、周期、分化以及骨吸收功能的影響,結(jié)果顯示:MGF-Ct24E不僅抑

8、制破骨前體細胞的增殖,還抑制破骨細胞的形成和分化,且具有濃度依賴性;此外,MGF-Ct24E對破骨細胞的骨吸收功能也存在較為顯著的抑制作用。②利用基因芯片檢測MGF-Ct24E對破骨細胞分化過程中基因表達的調(diào)控,結(jié)果表明MGF-Ct24E能有效調(diào)節(jié)破骨細胞基因的表達,差異表達基因總共1712個,其中上調(diào)717個,下調(diào)895個;qPCR檢測結(jié)果顯示所選擇的8差異表達基因(AKT2、SPP1、NF1、ITGB5、NFATc1、TRAF6、M

9、MP9和 CTSK)的差異表達情況與基因芯片實驗結(jié)果基本一致,驗證了基因芯片實驗結(jié)果的可靠性。③應用GoSurfer軟件和在線軟件DAVID對MGF-Ct24E調(diào)控破骨細胞差異表達的基因進行 GO分析,結(jié)果顯示富集指數(shù)最高的基因定位于細胞內(nèi)部、具有核苷酸結(jié)合功能、參與細胞周期進程。Pathway分析發(fā)現(xiàn)MGF-Ct24E調(diào)控的差異表達基因主要涉及細胞周期、DNA復制、錯配修復、核苷酸切除修復、同源重組、堿基切除修復、嘧啶代謝、TGF-β

10、信號通路、p53信號通路、硫酸乙酰肝素生物合成、孕激素介導的卵母細胞成熟、戊糖磷酸途徑、谷胱甘肽代謝通路、Wnt信號通路、嘌呤代謝通路、卵母細胞減數(shù)分裂、血管內(nèi)皮生長因子信號通路、肌動蛋白細胞骨架調(diào)控和白細胞跨內(nèi)皮遷移等20個信號通路。④對差異表達基因GO生物學過程第3~8層次的節(jié)點和Term進行仔細篩選,得到79個與破骨細胞密切相關(guān)聯(lián)的差異表達基因,進一步生物學過程GO分析發(fā)現(xiàn),上調(diào)基因主要富集的功能包括細胞分化,器官發(fā)育,骨骼發(fā)育,