交聯(lián)透明質(zhì)酸的制備、性質(zhì)及治療骨關(guān)節(jié)炎的療效研究.pdf

1、骨關(guān)節(jié)炎(osteoanhritis，OA)是一種嚴(yán)重危害中老年人健康的慢性退行性骨關(guān)節(jié)病，臨床上以膝關(guān)節(jié)發(fā)病最常見。隨著社會人口的老齡化，該病的發(fā)病率日益上升，我國約有6000萬～7000萬人患不同程度的OA。按美國風(fēng)濕病協(xié)會分類，OA分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩種，原發(fā)性O(shè)A是目前研究的重點(diǎn)。
　　 透明質(zhì)酸(hyaluronacid，HA)是一種大分子分散性線形糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG），由葡糖醛酸和N

2、-乙酰氨基葡萄糖的重復(fù)雙糖所組成，是關(guān)節(jié)滑液以及軟骨基質(zhì)的重要成分。20世紀(jì)70年代，Peyron等首先應(yīng)用關(guān)節(jié)腔注射HA治療OA患者，并形成了OA的黏彈性補(bǔ)充療法。但天然HA具有易溶于水、在體內(nèi)易降解、存留時間短等缺點(diǎn)，需要重復(fù)注射給藥。利用HA長鏈中的羧基、羥基和N-乙酰氨基三種官能團(tuán)，使其與不同的交聯(lián)劑反應(yīng)可得到不同類型的交聯(lián)透明質(zhì)酸(cross-linkedhyaluronacid，CHA)。CHA相對分子質(zhì)量Mr和分子體積顯著

3、增大，形成了連續(xù)的大分子網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在水中可溶脹但不再溶解，不僅保持了天然HA良好的生物相容性和體內(nèi)可降解性，而且具有更好的流變性能，機(jī)械強(qiáng)度和較高的穩(wěn)定性，延長其在體內(nèi)的存留時間。
　　 本課題研究了1，4-丁二醇二縮水甘油醚(1，4-Butanedioldiglycidylether，BDDE)與HA交聯(lián)制得不同交聯(lián)度的CHA凝膠，比較了三種CHA凝膠的流變學(xué)、抗自由基、抗酶降解等特性，并將CHA凝膠用于OA動物模型，探討其對

4、OA的治療作用及機(jī)制。研究中取得了以下幾個方面的成果。
　　 l制備了BDDE交聯(lián)的CHA凝膠研究制備了BDDE交聯(lián)的CHA凝膠，所建立的工藝與其他文獻(xiàn)以及專利相比簡單易行，且產(chǎn)品的純度高。
　　 2考察了CHA凝膠的性質(zhì)對CHA凝膠進(jìn)行了流變學(xué)性質(zhì)的研究。CHA凝膠與天然HA凝膠的黏度隨剪切頻率的增加而減少，其黏度表現(xiàn)出一種假塑性現(xiàn)象，CHA凝膠與天然HA凝膠這兩種高分子多聚物，均屬于非牛頓流體。CHA凝膠較天然HA凝

5、膠相比彈性模量G’和黏性模量G”都顯著升高，且G’遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于G”，G’、G”對頻率的依賴性不明顯，且其6角較小，CHA凝膠具有高彈性、強(qiáng)凝膠的特性。
　　 另外分別對CHA凝膠進(jìn)行抗自由基以及抗酶降解能力實驗。隨著交聯(lián)度的增加，CHA抵抗自由基以及透明質(zhì)酸酶的降解能力逐漸增強(qiáng)。
　　 3研究了CHA凝膠對OA動物模型的治療作用建立了木瓜蛋白酶誘導(dǎo)的兔膝OA模型，用CHA凝膠兔膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)單次注射，與生理鹽水和HA5次注射每周

6、一次為對照。給藥5周，取關(guān)節(jié)軟骨和滑膜進(jìn)行光鏡觀察，觀察關(guān)節(jié)軟骨和滑膜變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CHA凝膠均可顯著減輕兔膝OA，癥狀，療效與生理鹽水組相比有顯著性差異。
　　 4研究了CHA凝膠對兔膝OA的部分作用機(jī)制研究檢測了治療后兔膝OA模型關(guān)節(jié)滑液中的IL-lB、TNF-a水平，發(fā)現(xiàn)CHA可顯著降低IL-1B和TNF-a的表達(dá)水平，與生理鹽水組相比，有顯著性差異。
　　 實驗還用高效液相色譜法檢測了HA及CHA對軟骨蛋白

7、聚糖aggrecan的影響，CHA及HA凝膠可顯著降低滑液中硫酸軟骨素的含量，可能是通過抑制軟骨蛋白聚糖aggrecan的降解或上調(diào)蛋白聚糖的合成，對維持關(guān)節(jié)軟骨正常的新陳代謝發(fā)揮了作用。
　　 本研究取得的主要研究成果和結(jié)論如下：
　　 (1)研究了以BDDE為交聯(lián)劑制備不同交聯(lián)度CHA凝膠的工藝，該工藝簡單易行，并且具有產(chǎn)品純度高凝膠顆粒均勻等特點(diǎn)，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
　　 (2)流變學(xué)測定CHA黏性模量和彈性

8、模量較天然HA高，CHA凝膠具有高彈性、強(qiáng)凝膠的特性。
　　 (3)抗酶和抗自由基實驗證明了CHA凝膠具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，能較強(qiáng)地抵抗透明質(zhì)酸酶和羥自由基的降解，延長其在體內(nèi)存留時間。
　　 (4)考察pH值及不同的緩沖體系對CHA穩(wěn)定性的影響，CHAI、CHAII、CHAⅢ在pH為5.0～9.0的條件下性質(zhì)都比較穩(wěn)定。CHAII在pH8.0的硼酸鹽緩沖體系，以及pH6.0、pH7.0、prig.0的磷酸鹽緩沖體系，pH7

9、.0、pH8.0的枸椽酸鹽緩沖體系都可穩(wěn)定存在。
　　 (5)用木瓜蛋白酶誘導(dǎo)的兔膝OA模型考察CHA凝膠對OA的療效，研究證實CHA可減少給藥次數(shù)，保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨，減輕炎癥，顯著改善兔膝OA癥狀。
　　 (6)從免疫分子水平探討了CHA凝膠對OA的部分作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)CHA可顯著降低兔膝OA模型關(guān)節(jié)滑液中IL-lB和TNF-a的表達(dá)水平。高效液相色譜測定關(guān)節(jié)滑液中硫酸軟骨素的含量，發(fā)現(xiàn)CHA及HA可顯著降低滑液中硫酸軟骨素