中藥苧麻根抗乙肝病毒活性及其化學(xué)成分研究.pdf

1、苧麻根為蕁麻科苧麻屬多年生草本植物苧麻(Boehmeria nivea(L.)Gaud)的干燥根及根莖。苧麻根甘寒,無毒,歸心、肝、腎、膀胱經(jīng),有涼血、止血、散瘀之功效,臨床上主要用于治療創(chuàng)傷出血、咯血、尿血、肛門腫痛、乳癰、丹毒、脫肛不吸、赤白帶下、婦人子宮炎,還治熱病大渴、跌打損傷、蛇蟲咬傷。以往有關(guān)苧麻根治療乙型肝炎的報(bào)道不多,近年來苧麻根抗肝炎活性日益受到國內(nèi)外學(xué)者的高度關(guān)注。臺(tái)灣學(xué)者Kai-Ling Huang等研究發(fā)現(xiàn)在He

2、pG2.2.15細(xì)胞乙型肝炎模型中,苧麻根提取物對(duì)乙肝e抗原(HBeAg)的分泌有抑制作用且呈劑量依賴性；臺(tái)灣工業(yè)技術(shù)研究院從苧麻中提取得到代號(hào)為BMEC—101的提取物(含兩種多酚)抗乙肝作用明顯,已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段；臺(tái)灣綠益康生物科技公司利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育的新型苧麻開發(fā)的保健品,具有治療肝病、清除自由基的效果。我院肝炎科臨床使用也發(fā)現(xiàn),苧麻根治療乙肝療效顯著。
　　 本課題包括苧麻根的抗乙肝病毒活性研究和化學(xué)成分研究兩部分,

3、通過對(duì)活性篩選和化學(xué)成分的研究,尋找其特征性成分和活性成分,建立方便、快捷、準(zhǔn)確的定性和定量方法,從而為制定客觀、專屬、科學(xué)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),為控制苧麻根藥材的質(zhì)量,保證中醫(yī)臨床用藥安全、有效提供依據(jù)。
　　 首先,采用國際上通用的Hep G2.2.15細(xì)胞系乙肝病毒細(xì)胞模型,對(duì)苧麻根5個(gè)分離部位(苧麻根水洗脫部位、苧麻根40％乙醇洗脫部位、苧麻根70％乙醇洗脫部位、苧麻根水不溶部位和苧麻根總提取物)進(jìn)行了活性篩選實(shí)驗(yàn),采用酶聯(lián)免疫法

4、檢測(cè)細(xì)胞上清中乙肝表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)的分泌量,Real time PCR的方法檢測(cè)細(xì)胞中乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA),分別計(jì)算對(duì)病毒半數(shù)抑制濃度IC50及選擇指數(shù)SI。方法成熟,結(jié)果可靠。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明5個(gè)供試品對(duì)Hep G2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)液中HBsAg、HBeAg的分泌均沒有明顯的抑制作用；苧麻根水洗脫部位、苧麻根水不溶部位、苧麻根40％乙醇洗脫部位三個(gè)供試品抑制HBV-DNA復(fù)制的SI均大于2,分

5、別為2.5、7.2、10.6,為有效低毒。以此實(shí)驗(yàn)的結(jié)果指導(dǎo)今后的工作,有目的地重點(diǎn)分離活性部位并建立活性成分的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),為進(jìn)一步開發(fā)抗乙肝新藥提供依據(jù)。
　　 其次,對(duì)苧麻根藥材乙醇提取物的化學(xué)成分進(jìn)行了研究,應(yīng)用現(xiàn)代色譜技術(shù),采用多種分離方法,從中分離得到了29個(gè)化合物,并利用理化性質(zhì)和現(xiàn)代波譜學(xué)方法鑒定了其中23個(gè)化合物,分別是7個(gè)三萜類化合物,1個(gè)芪類化合物,4個(gè)蒽醌類化合物,2個(gè)黃酮類化合物,3個(gè)甾醇類化合物,2個(gè)酚類

6、化合物,2個(gè)倍半萜類化合物,1個(gè)有機(jī)酸類化合物和1個(gè)無機(jī)化合物。其中,2個(gè)為新化合物(1,7),13個(gè)為首次從該植物中分離得到的化合物((6、8、10、12、13、14、16、18～23))。化合物的結(jié)構(gòu)如表1。
　　 7個(gè)三萜類化合物(1～7)依次分別為:3β,11α,19α-三羥基-12-烯-28-烏蘇酸(3β,11α,19α-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid),常春藤皂苷元(hederagen

7、in),齊墩果酸(oleanolic acid),熊果酸(ursolic acid),坡模酸(pomolic acid),3α,19α-二羥基-12-烯-28-烏蘇酸(3α,19α—dihydroxyurs-12-en-28-oic acid),19α-羥基烏蘇-12-烯-3-氧-28-(19α-hydroxy-12-en-3-oxo—28-acid)
　　 1個(gè)芪類化合物為:白藜蘆醇苷(polydatin)(8)
　　

8、 4個(gè)蒽醌類化合物(9～12)分別為:大黃素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷
　　 (emodin-8-O-β-glucopyranoside),大黃素甲醚(physcion),大黃素(emodin),1,2-二羥基-6-甲氧基-3-甲基-9,10-二酮-8 O-β-D-吡喃葡萄糖苷(1,2-dihydroxy-6-methoxy-3-methylanthracene-9,10-dione-8-O-β-glucopyanoside

9、)
　　 2個(gè)黃酮類化合物為:表兒茶素(epicatechin)(13),兒茶素(catechin)(14)
　　 3個(gè)甾醇類化合物為:胡蘿卜苷(Daucosterol)(15),豆甾醇-3-D-β-D-吡喃葡萄糖苷(Stigmasterol-3-O-β—D—glucopyranoside)(16),β-谷甾醇(β-sitosterol)(17)
　　 2個(gè)酚類化合物為:3,4-二羥基苯甲酸乙酯(ethyl3,4

10、-dihydroxybellzoate)(18),對(duì)羥基苯甲酸乙酯(Ethyl p-hydroxybenzoate)(19)
　　 2個(gè)倍半萜類化合物為:3-氧-α-紫羅蘭醇(G6差向異構(gòu)體)(3-oxo-α-ionol(C6Epimer))(20,21)
　　 1個(gè)有機(jī)酸類化合物為9,10,11-Trihydroxy-(12Z)-12-octadeceIloic acid(22)
　　 1個(gè)無機(jī)化合物為KNO3

11、(23)
　　 另外6個(gè)尚未最終完全鑒定的成分中,初步推斷有4個(gè)為糖脂,2個(gè)為黃酮。
　　 在化學(xué)成分研究的基礎(chǔ)上,我們以苧麻根中分離得到的坡模酸作為對(duì)照品,建立了高效液相法測(cè)定苧麻根中坡模酸含量方法。測(cè)定條件:色譜柱為Restek C18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),流動(dòng)相為甲醇-0.5％磷酸水(70:30),流速1ml·min-1,檢測(cè)波長210nm；柱溫25℃。通過對(duì)精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、回收率等方法

12、學(xué)考察,結(jié)果顯示,該方法準(zhǔn)確、靈敏、簡單、快捷,為定量控制中藥苧麻根質(zhì)量和進(jìn)一步制定科學(xué)規(guī)范的藥材標(biāo)準(zhǔn)提供了參考依據(jù)。
　　 同時(shí)從苧麻根中分得的長春藤皂苷元、齊墩果酸、熊果酸、坡模酸、3α,19α-二羥基-12-烯-28-烏蘇酸等作為對(duì)照品對(duì)苧麻根藥材進(jìn)行薄層鑒別的實(shí)驗(yàn)研究,通過進(jìn)行薄層色譜條件的優(yōu)化,最終確定了以乙醚100ml超聲處理30分鐘作為供試品的制備方法,薄層條件使用硅膠GF254薄層板,正己烷-丙酮(3:1)為展開