IL-1β和TNF-α及其基因多態(tài)與成人牙周炎的相關(guān)性研究.pdf

1、中文摘要公目的承人牙周炎、adultperiodontitisAP，是發(fā)生于牙周支持組織的慢性，癥性疾病，是人群中的常見病和多發(fā)病。盡管目前已有許多研究資料，然“9對其發(fā)病機(jī)制尚無統(tǒng)一認(rèn)識。已有研究表明，特異的革蘭氏陰性厭氧菌刀其產(chǎn)物與該病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，且牙周炎的病理表現(xiàn)大多數(shù)是宿主對牙周組織局部的微生物菌叢發(fā)生反應(yīng)的結(jié)果。脂多搪(lipopolysaaharideLPS)是包括參與牙周炎的菌種在內(nèi)革蘭因陰性菌外膜的主要成分。LPS

2、能激活宿主細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞因子，包括IL113和TNF一“。IL一1p和TNF一a主要功能是致炎作用，并能直接或間梢地介導(dǎo)骨組織吸收。研究表明，炎癥牙眼位點(diǎn)的眼溝液和牙眼組織中IL一Ip及TNF一?；钚愿哂诜茄装Y性位點(diǎn)。提示IL一‘p及TNF一。可能在州周炎的發(fā)病機(jī)制中起一定作用。然而牙周炎患者炎癥牙眼組織中IL一Ip及TNF一。在mRNA水平的研究尚未見報(bào)道。而且關(guān)于產(chǎn)生IL一1p及TNF一a的細(xì)胞及在活體牙周組織中IL一甲及TNF一。

3、產(chǎn)生機(jī)制還不完全清楚。另外，有研究表明，IL一1p和TNF一a在不同個(gè)體的產(chǎn)生有很大捌異。最近已發(fā)現(xiàn)幾個(gè)IL一1基因多態(tài)和幾種TNF一a基因多態(tài)，其中IL一1一三個(gè)基因型中一個(gè)基因型在3953位點(diǎn)與IL一1p產(chǎn)生增多有關(guān)，定位于TNF一a基因啟動子IK域一308位點(diǎn)單個(gè)堿基對多態(tài)(SBPP)與TNF一。產(chǎn)生能力不疾病相關(guān)在病例對照研究中，這些基因多態(tài)與嚴(yán)重的慢性炎癥性周炎是一種慢性炎癥性疾病，本實(shí)驗(yàn)采用RT一PCR#I術(shù)，從mRNA水平

4、檢測成人牙周炎炎性牙眼組織及正常牙眼組織中ILmRNATNFamRNA.jt黛ILITNFt11ILIPATNFahA3F1Itcz#fL11iEo(#1RfMWY“7FMiPCRRFLP53“rTLIR.“mTNFa3wVftjjM25qhf13FflI，~~~~~~~~~~分孵茄10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性滴加正常血清室溫孵育20，分別滴加抗IL一1(3TNF一。、CD68CD20和CD3單克隆抗體，室溫一。、巨噬細(xì)胞、B細(xì)

5、胞和T細(xì)胞然后滴育鐘育一.二抗小時(shí)，分別標(biāo)記IL一1(3TNF，室溫孵育30分鐘滴加SP室溫孵育30分鐘，DAB顯色。TNF一a和IL一1(3陽性染色細(xì)胞胞漿見黃褐色顆粒。在光鏡下每一切片選取5個(gè)有沸比代表性的區(qū)域，在200x視野計(jì)數(shù)TNF一。和IL一1(3陽性的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算每一視野下的陽性細(xì)胞數(shù)。兩組間TNF一。和IL一1R陽性細(xì)胞均數(shù)的較采用t檢驗(yàn)。血塞神采集中重度成人牙周炎患者(AP)共1ml。采用飽和NaCl法提取外周血DNA1

6、24例和正常對照172例靜脈。采用PCR方法擴(kuò)增TNF一。因TNF一A和IL一1p基因在內(nèi)的DNA片段，IL一IL一1B區(qū)域含突變點(diǎn)，F(xiàn)一_3oaa和IL一1p十1B正引物序列為5’一CTCAGGTGTCCTdCAAGAAATCAAA一3，負(fù)引物序列為5’一GCTTT1TfGCTGTGAGT000G十3.TNF一A正引物序列為:5，一AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT一3，負(fù)喇1物序列為:5‘一ACACTCCCCATCCTC

7、CCGGCT一3oIL一1B和TNF一APCIR產(chǎn)物片段長度分別為‘94by和“7by。IL一‘a(chǎn)基因‘94bp區(qū)域的擴(kuò)增朱件為:95902min，以949030秒，589030秒，729045秒循環(huán)35次，最后72嘴延伸5分鐘。10ulIL一1p基因擴(kuò)增產(chǎn)物中加人4U限制性內(nèi)切酶Taq，65℃水浴“小時(shí)，等位基因1純合子(11)個(gè)體產(chǎn)生86bp和108bp兩個(gè)片段，等位基因2純合子(22)個(gè)體產(chǎn)生194bp一個(gè)片段，雜合子個(gè)體(12產(chǎn)

8、生194bp108bp和86bp三個(gè)片段。TNF一a基因117bp區(qū)域的擴(kuò)增條偉為:95℃變性5分鐘，以950C巧秒，609030秒順序循環(huán)35次，最后729v舉伸5分鐘。取10u1擴(kuò)增產(chǎn)物，加人2U內(nèi)切酶NcoI(Promega)，37℃水冷3小時(shí)。等位基因1純合子(11)個(gè)體產(chǎn)生20bp和97如兩個(gè)片段，等位摹因2純合子(22)個(gè)體產(chǎn)生1176p一個(gè)片段，雜合子個(gè)體(12)產(chǎn)生117如卜97b“和20bp三個(gè)片段。酶切產(chǎn)物以‘2%聚