采前光照誘導(dǎo)抗氧化物積累抑制‘Anjou’梨果實(shí)虎皮病發(fā)生的生化及分子機(jī)制.pdf

1、虎皮?。⊿uperficial scald）是影響‘Anjou’梨采后貯藏壽命的主要生理性病害，嚴(yán)重影響果實(shí)的外觀和商品價(jià)值?；⑵げ〉陌l(fā)生是某些梨和蘋果品種在貯藏之后出現(xiàn)的因表皮細(xì)胞氧化造成的棕褐色病變。一般認(rèn)為α-法尼烯的氧化產(chǎn)物共軛三烯是造成表皮褐化，產(chǎn)生虎皮病的關(guān)鍵因素?；⑵げ〉陌l(fā)生受采前溫度、果實(shí)成熟度、采后貯藏溫度、氣調(diào)貯藏氣體比例、乙烯合成等多個(gè)因素的影響。在本研究中，前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)‘Anjou’梨果實(shí)著色面在八個(gè)月的長(zhǎng)期貯藏

2、中也沒有虎皮病的發(fā)生，說明虎皮病的發(fā)生與采前光照有密切聯(lián)系。因此，闡明光照誘導(dǎo)果實(shí)著色和抑制虎皮病發(fā)生的分子機(jī)理對(duì)于梨和蘋果的采后貯藏意義重大。
　　本研究以綠‘Anjou’(Pyrus communis L. cv. d’Anjou’)為試材，利用套袋處理，去除采前光照的影響。首先比較了套袋處理對(duì)綠‘Anjou’梨乙烯、呼吸、果實(shí)硬度、α-法尼烯、共軛三烯和虎皮病發(fā)生的影響。研究結(jié)果表明遮光處理對(duì)果實(shí)貯藏期間的乙烯、呼吸和后熟性

3、狀沒有影響，顯著降低了可溶性固形物的含量；但是遮光處理明顯增加了α-法尼烯和共軛三烯的含量，促進(jìn)了虎皮病的發(fā)生。進(jìn)一步分析表明，α-法尼烯和共軛三烯僅在低溫貯藏過程中積累，在后熟過程中都呈下降的趨勢(shì)，由此說明，虎皮病的發(fā)生與低溫下α-法尼烯尤其是共軛三烯的積累量有關(guān)。
　　研究結(jié)果表明α-法尼烯在果實(shí)陽(yáng)面和果實(shí)陰面中的含量相近，但共軛三烯的含量在果實(shí)陽(yáng)面中明顯低于果實(shí)陰面。果實(shí)陽(yáng)面中積累了豐富的抗氧化物質(zhì)（如花青素、多酚、類黃酮、

4、黃烷醇），從而導(dǎo)致總抗氧化性的提高，抑制了α-法尼烯向共軛三烯的氧化過程。另外，果實(shí)陽(yáng)面中的SOD、MDAR、APX、DHAR、GR等抗氧化酶也明顯高于果實(shí)陰面，這些抗氧化酶使果實(shí)陽(yáng)面具有更高的去除超氧陰離子自由基（O2-）、羥基自由基（-OH）、過氧化氫（H2O2）等自由基的能力。減輕了共軛三烯對(duì)果皮細(xì)胞的氧化傷害，從而減輕了虎皮病的發(fā)生。
　　為了進(jìn)一步闡明虎皮病發(fā)生的分子機(jī)理，本文以綠‘Anjou’和紅‘Anjou’果實(shí)為試

5、材，克隆了兩個(gè)品種的α-法尼烯合成酶基因（AFS），命名為PcAFS1。cDNA全長(zhǎng)1952 bp，編碼577個(gè)氨基酸，兩者同源性為99.3％。進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，PcAFS1與蘋果α-法尼烯合成基因同源性最高。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，PcAFS1在‘Anjou’果實(shí)、幼葉、老葉、花中都有表達(dá)，但在成熟度高的果皮中表達(dá)量最高；并且受乙烯的誘導(dǎo)。在采后低溫貯藏過程中表達(dá)上升，1-MCP處理可以抑制該基因的表達(dá)。克隆比較了兩個(gè)品種PcAFS1基

6、因的啟動(dòng)子，啟動(dòng)子序列全長(zhǎng)2067 bp，同源性99.6%，兩者相差9個(gè)堿基。PLANTCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線分析了啟動(dòng)子上的順式元件，發(fā)現(xiàn)PcAFS1的啟動(dòng)子含有HSE（熱激響應(yīng)原件）和MBS（MYB結(jié)合位點(diǎn)），說明該基因有可能受溫度和MYB轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。為了進(jìn)一步確定PcAFS1基因的功能，我們構(gòu)建了pBI121-PcA

7、FS1過量表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌侵染法浸染擬南芥花序。分析了轉(zhuǎn)基因擬南芥的α-法尼烯積累，表明PcAFS1可以促進(jìn)α-法尼烯合成。用乙烯（0.2μl l-1）處理轉(zhuǎn)基因擬南芥，α-法尼烯積累上升，并發(fā)現(xiàn)蓮座葉有向下彎曲的現(xiàn)象。
　　花青素在光照和套袋處理中差異最大，說明花青素可能在虎皮病的發(fā)生過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。為了進(jìn)一步確定花青素和虎皮病發(fā)生的分子機(jī)理，以綠‘Anjou’和紅‘Anjou’果皮為試材，利用差異篩選的方法，得到一個(gè)

8、表達(dá)差異極為顯著地花青素調(diào)控MYB轉(zhuǎn)錄因子，命名為PcMYB1。該基因只在紅‘Anjou’果皮中表達(dá)，在綠‘Anjou’沒有表達(dá)。在綠‘Anjou’和紅‘Anjou’果皮克隆了 PcMYB1的啟動(dòng)子序列，比對(duì)發(fā)現(xiàn)兩者同源性達(dá)99.3%，只有12個(gè)堿基的差異；克隆了兩者的基因組序列，發(fā)現(xiàn)紅‘Anjou’與綠‘Anjou’相比，在第一個(gè)內(nèi)含子上缺失了244個(gè)堿基。推測(cè)是因?yàn)閮?nèi)含子的缺失造成的基因轉(zhuǎn)錄水平的差異和造成綠‘Anjou’果實(shí)變紅。

9、
　　在果實(shí)貯藏前期，紅‘Anjou’中α-法尼烯的積累比綠‘Anjou’要高。1-MCP處理的紅‘Anjou’PcAFS1的基因表達(dá)在果實(shí)貯藏后期可以部分恢復(fù)，在綠‘Anjou’中完全被抑制。為了確定PcMYB1是否調(diào)控PcAFS1的基因表達(dá)，用35S::PcMYB1、35S::PcbHLH3、35S::PcWD40與PPcAFS1::LUC共轉(zhuǎn)化煙草葉片，發(fā)現(xiàn)PcMYB1促進(jìn)PcAFS1的基因表達(dá)，但是這種促進(jìn)作用不受花青素調(diào)

10、控因子bHLH或WD40的影響。說明PcMYB1對(duì)α-法尼烯的調(diào)控機(jī)制與花青素不同。
　　根據(jù)本研究的結(jié)果，我們對(duì)光照抑制‘Anjou’梨虎皮病的發(fā)生做了以下總結(jié)和推測(cè)：在生化層面，光照促進(jìn)了花青素、多酚、類黃酮、黃烷醇等抗氧化物質(zhì)的積累，提高了SOD、MDAR、APX、DHAR、GR等抗氧化酶的活性，從而導(dǎo)致總抗氧化性的提高，抑制了α-法尼烯向共軛三烯的氧化過程，構(gòu)成了果實(shí)陽(yáng)面對(duì)虎皮病的天然抗性。在分子機(jī)理層面，PcMYB1在紅