hOPG基因治療大鼠絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、隨著社會(huì)的發(fā)展，人口老齡化的趨勢(shì)越來(lái)越明顯，與之相應(yīng)的是原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生率明顯增高，尤其是骨質(zhì)疏松性骨折發(fā)病率很高，甚至有一定的死亡率，給社會(huì)、家庭和個(gè)人帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。積極防治骨質(zhì)疏松癥已成為老齡化社會(huì)衛(wèi)生保健的突出問(wèn)題。 引起骨質(zhì)疏松癥的原因較多，但其根本原因是破骨細(xì)胞數(shù)量增多、功能亢進(jìn)，骨吸收速率超過(guò)骨形成。因此，治療骨質(zhì)疏松癥的策略大多為抑制破骨細(xì)胞。hOPG是1997年發(fā)現(xiàn)的，屬于TNFR超家族的分泌型糖蛋白

2、，由骨髓基質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞產(chǎn)生，能強(qiáng)有力的抑制破骨細(xì)胞的分化、活化并誘導(dǎo)其凋亡。在骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型及絕經(jīng)后婦女應(yīng)用體外重組hOPG后，均能有效的防止骨量丟失。盡管hOPG可以通過(guò)體外重組，以蛋白的形式給藥，但骨質(zhì)疏松癥是慢性病，需要長(zhǎng)時(shí)間、反復(fù)給藥，并存在獲得有生理活性的hOPG困難，hOPG蛋白分子量大、性質(zhì)不穩(wěn)定、體內(nèi)的半衰期短、會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)等缺點(diǎn)。因此，直接運(yùn)用hOPG治療骨質(zhì)疏松癥存在較多的問(wèn)題。為此，我們擬通過(guò)基因重組技

3、術(shù)，以腺病毒為載體，將hOPG基因?qū)塍w內(nèi)，行hOPG基因治療骨質(zhì)疏松癥的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)分三部分： 1.Ad-hOPG的構(gòu)建、制備、滴度測(cè)定及體外表達(dá)； 2.Ad-hOPG在大鼠體內(nèi)表達(dá)特點(diǎn)； 3.Ad-hOPG對(duì)OVX大鼠骨質(zhì)疏松癥的治療作用。 方法：1.在含有hOPGcDNA的質(zhì)粒PUC19-hOPG中切取目的基因，與穿梭質(zhì)粒AdTrack-CMV通過(guò)基因重組技術(shù)，構(gòu)建Adtrack-CMV-hOP

4、G質(zhì)粒，在BJ5183-Adeasy-1菌中與腺病毒基因組進(jìn)行同源重組，構(gòu)建含hOPG的重組腺病毒的DNA； 2.在293細(xì)胞中包裝、擴(kuò)增Ad-hOPG，并測(cè)定病毒滴度，PCR鑒定重組腺病毒DNA，Westernblot鑒定體外細(xì)胞表達(dá)蛋白； 3.通過(guò)尾靜脈將Ad-hOPG注入大鼠體內(nèi)，在不同時(shí)象點(diǎn)取肝、脾、腎、心等內(nèi)臟標(biāo)本，行冰凍切片，熒光顯微鏡下檢測(cè)Ad-hOPG報(bào)告基因(GFP)的表達(dá)，觀察不同滴度Ad-hOPG的

5、表達(dá)特點(diǎn)，選擇最佳滴度的Ad-hOPG進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)； 4.選用10月齡、未孕產(chǎn)雌性SD大鼠隨機(jī)分為3組：Sham組(假手術(shù)+不治療)、NS組(切除卵巢+生理鹽水治療)和Ad-hOPG組(切除卵巢+Ad-hOPG治療)。術(shù)后8周Sham組不行任何干預(yù)，NS組和Ad-hOPG組分別行生理鹽水和3.16×109pfu/ml的Ad-hOPG注射。干預(yù)后48h開(kāi)始定期測(cè)定血清hOPG濃度，并于干預(yù)后35d時(shí)行大鼠X片、骨密度、骨生物力學(xué)

6、特性、骨形態(tài)學(xué)、破骨細(xì)胞數(shù)量等檢測(cè)。 結(jié)果：1.成功的構(gòu)建了Ad-hOPG的DNA，經(jīng)酶切及PCR鑒定證實(shí)完全正確。 2.成功包裝出Ad-hOPG，經(jīng)TCID50法測(cè)定重組腺病毒最高滴度為3.16×109pfu/ml，并在293細(xì)胞中擴(kuò)增足量的Ad-hOPG，PCR鑒定重組腺病毒DNA中的確含有hOPG基因，Westernblot檢測(cè)證實(shí)體外可穩(wěn)定表達(dá)OPG。 3.注射3.16×107、3.16×108pfu/m

7、l的Ad-hOPG在體內(nèi)表達(dá)弱、持續(xù)時(shí)間短，分別只有10d和16d。注射3.16×109pfu/ml的Ad-hOPG2d后即在肝、脾能檢測(cè)到較強(qiáng)的表達(dá)，心、腎也有表達(dá)；6d左右達(dá)到高峰，持續(xù)到26d時(shí)還能檢測(cè)GFP的表達(dá)。 4.①hOPG血清濃度測(cè)定Sham組和NS組因小于ELISA試劑盒的最小測(cè)定值0.2ng/ml，未能測(cè)出。Ad-hOPG組的干預(yù)后2h為2.511μg/ml，6d時(shí)達(dá)到高峰62.342μg/ml，30d時(shí)仍有

8、0.0354μg/ml，34d時(shí)未能檢測(cè)出。②大鼠X片檢測(cè)Sham組大鼠骨質(zhì)密度沒(méi)有明顯改變，NS組大鼠骨質(zhì)密度有輕度減低，椎體改變較四肢更為明顯；Ad-hOPG組大鼠骨質(zhì)密度較NS組大鼠高，甚至比Sham組大鼠還高，主要表現(xiàn)在椎體，股骨下端、脛骨上端干骺端以及髂骨近端等處。③DEXA檢測(cè)骨密度NS組與Sham組比較，股骨BMD有顯著下降(P＜0.05)，腰椎BMD非常明顯的下降(P＜0.01)；Ad-hOPG組股骨BMD比較NS組有非

9、常顯著的增加(P＜0.01)，與Sham組無(wú)明顯差異(P＞0.05)，腰椎BMD比較NS組有非常顯著的增加(P＜0.01)，與Sham組無(wú)明顯差異(P＞0.05)。④股骨生物力學(xué)性能Ad-hOPG組股骨結(jié)構(gòu)力學(xué)(最大橈度、最大載荷、最大能量吸收)、材料力學(xué)(最大應(yīng)力、彈性模量)與NS組相比，均有非常顯著性改變(P＜0.01)，與Sham組相比，均沒(méi)有顯著性改變(P＞0.05)。椎體生物力學(xué)性能：Ad-hOPG組結(jié)構(gòu)力學(xué)(最大橈度、最大載

10、荷、最大能量吸收)、材料力學(xué)(最大應(yīng)力、彈性模量)與NS組相比，均有非常顯著性改變(P＜0.01)，與Sham組相比，均沒(méi)有顯著性改變(P＞0.05)。⑤骨形態(tài)學(xué)觀察光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)Sham組骨小梁排列密集，并呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，骨小梁間距?。籒S組骨小梁明顯減少、排列稀疏，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)缺如，骨小梁間距增寬；Ad-hOPG組與NS組相比，骨小梁數(shù)目明顯增多、排列密集，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、骨小梁連接明顯增多。⑥破骨細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)Sham組在密集網(wǎng)狀骨小梁間、骺板

11、上下有較多染為紅色的TRAP染色陽(yáng)性細(xì)胞；NS組在細(xì)而稀疏的骨小梁間有大量TRAP染色陽(yáng)性細(xì)胞；Ad-hOPG組在脛骨干骺端幾乎見(jiàn)不到TRAP染色陽(yáng)性細(xì)胞。 結(jié)論：1.利用穿梭質(zhì)粒Adtrack-CMV-hOPG及Adeasy-1菌成功構(gòu)建了Ad-hOPG的DNA，并制備了較高滴度的Ad-hOPG(3.16×109pfu/ml)。 2.不同滴度的Ad-hOPG均能在大鼠體內(nèi)表達(dá)，表達(dá)的強(qiáng)弱、時(shí)間長(zhǎng)短與滴度呈正相關(guān)，較高滴