表皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路在激素依賴(lài)性乳腺癌內(nèi)分泌治療中的作用.pdf

1、本課題研究EGFR信號(hào)通路在TAM治療形成耐藥過(guò)程中的作用機(jī)制，并研究通過(guò)阻斷EGFR信號(hào)通路治療乳腺癌的可行性。主要包括三個(gè)部分：1.表皮生長(zhǎng)因子受體在乳腺癌組織中的表達(dá)與臨床意義；2.表皮生長(zhǎng)因子受體通路參與乳腺癌細(xì)胞對(duì)三苯氧胺耐藥的研究；3.表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑對(duì)乳腺癌裸鼠模型的作用研究。 1、表皮生長(zhǎng)因子受體在乳腺癌組織中的表達(dá)與臨床意義 [目的]研究表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)在乳腺癌組織中的表達(dá)，以及與其他

2、生物學(xué)指標(biāo)和臨床指標(biāo)的關(guān)系，用于指導(dǎo)乳腺癌的臨床治療及判斷預(yù)后。 [材料和方法]實(shí)驗(yàn)標(biāo)本來(lái)自南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺內(nèi)分泌外科，2004年5月至2004年12月間乳腺疾病患者。均有組織病理學(xué)確診。切取新鮮組織標(biāo)本放液氮中冷凍后，-70℃保存?zhèn)溆谩２捎脽晒舛磕孓D(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(fqRT-PCR)檢測(cè)EGFRmRNA的表達(dá)，采用免疫組織化學(xué)法(S-P法)檢測(cè)EGFR、Her-2、ER、PR和p53的表達(dá)，并分析EGFR與各指標(biāo)

3、的關(guān)系。 [結(jié)果]正常乳腺組織標(biāo)本10例，乳腺癌組織標(biāo)本55例。其中浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌48例，導(dǎo)管內(nèi)癌3例，小葉癌4例。臨床分期(pTNM)：Ⅰ期14例，Ⅱ期25例，Ⅲ～Ⅳ期16例。 根據(jù)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果，計(jì)算EGFR的相對(duì)含量，在正常的乳腺組織中Rnormal值在0.14～1.41之間，平均值為0.75±0.36；在乳腺癌組織中，Rsample值在0.002～23.42之間。與正常乳腺組織相比，58.2﹪(32

4、/55)的腫瘤組織中EGFR的mRNA是低表達(dá)，即Rsample＜0.03；有7.3﹪(4/55)的腫瘤組織中為過(guò)表達(dá)，即Rsample＞2.55，其余34.5﹪(19/55)的腫瘤組織中EGFRmRNA表達(dá)在正常值范圍。 運(yùn)用S-P免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各生物學(xué)指標(biāo)的陽(yáng)性表達(dá)率分別為：EGFR50.9﹪(28/55)；Her-232.7﹪(18/55)；ER56.4﹪(31/55)；PR58.2﹪(32/55)；p5352.7﹪(

5、29/55)。進(jìn)一步分析顯示，EGFR的表達(dá)與Her-2和p53的陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)(rn值分別為0.297，0.454，P值分別為0.027，0.001)。EGFR的陽(yáng)性表達(dá)與ER、PR的陽(yáng)性表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rn值分別為-0.424，-0.316，P值分別為0.002，0.019)。EGFR的陽(yáng)性表達(dá)與患者年齡(以50歲為界)、腫塊大小無(wú)關(guān)(P值分別為0.135，0.075)，但是與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況呈正相關(guān)(rn值分別為0.468

6、，0.441，P值分別為0.000，0.001)。 [結(jié)論]EGFR在乳腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)率為50.9﹪。EGFR表達(dá)與Her-2、p53表達(dá)呈正相關(guān)，而與ER、PR的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。EGFR的陽(yáng)性表達(dá)與患者年齡(以50歲為界)、腫塊大小(以3cm為界)無(wú)關(guān)，而與患者的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況呈正相關(guān)。EGFR高表達(dá)是乳腺癌預(yù)后差的重要指標(biāo)之一。EGFR及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以作為抗腫瘤治療的新的作用靶點(diǎn)。乳腺癌組織中EGFRmRNA過(guò)

7、表達(dá)率并不高，與蛋白表達(dá)水平并不一致，提示了EGFR的表達(dá)存在著復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制，如轉(zhuǎn)錄加強(qiáng)或降解缺陷等。 2、表皮生長(zhǎng)因子受體通路參與乳腺癌細(xì)胞對(duì)三苯氧胺耐藥的研究 [目的]研究乳腺癌細(xì)胞給予三苯氧胺(TAM)處理后，產(chǎn)生TAM耐藥過(guò)程中表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用，以及EGFR抑制劑AG1478對(duì)耐藥細(xì)胞的影響。 [材料和方法]選擇雌激素受體(ER)陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞MCF-7(中國(guó)科學(xué)院上海生

8、化細(xì)胞所)，持續(xù)給予10-7mol/LTAM(sigma公司)處理，建立TAM耐藥細(xì)胞(T-MCF-7)。采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)；選擇Westernblot方法檢測(cè)EGFR、ER、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的表達(dá)情況；應(yīng)用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(fqRT-PCR)檢測(cè)EGFRmRNA的表達(dá)水平；流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡。 [結(jié)果]在TAM處理初期，MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)

9、受到抑制，在1～2個(gè)月時(shí)，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制最為顯著。持續(xù)給予TAM處理6個(gè)月，T-MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)速度逐漸恢復(fù)治療前的狀態(tài)。TAM細(xì)胞生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)也證明T-MCF-7細(xì)胞對(duì)TAM不敏感。說(shuō)明已經(jīng)建立了對(duì)TAM耐藥的T-MCF-7細(xì)胞。 fqRT-PCR方法檢測(cè)結(jié)果顯示，T-MCF-7細(xì)胞較MCF-7細(xì)胞中EGFRmRNA的表達(dá)量增加約4.5倍(RT=0.097±0.023，Rw=0.021±0.011)，表達(dá)量差異有顯著性(P＜

10、0.05)。說(shuō)明MCF-7細(xì)胞經(jīng)過(guò)TAM處理后，其EGFRmRNA的表達(dá)水平明顯升高。 Westernblot結(jié)果顯示，T-MCF-7細(xì)胞中EGFR蛋白表達(dá)高于對(duì)照組MCF-7細(xì)胞(P＜0.05)。兩種細(xì)胞中ERK1/2總蛋白含量無(wú)差別，但p-ERK1/2蛋白在T-MCF-7細(xì)胞中表達(dá)高于對(duì)照組(P＜0.05)。ER蛋白表達(dá)水平在兩者間無(wú)差異(P＞0.05)。說(shuō)明了EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性水平提高。 EGFR抑制劑AG

11、1478進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)，結(jié)果表明AG1478對(duì)T-MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率高于MCF-7(P＜0.05)，TAM耐藥的乳腺癌細(xì)胞對(duì)EGFR抑制劑更敏感。說(shuō)明了EGFR信號(hào)通路在TAM耐藥細(xì)胞中的重要作用。 應(yīng)用FCM檢測(cè)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，對(duì)于MCF-7細(xì)胞，TAM和AG1478都可阻滯細(xì)胞于G0/G1期，使G0/G1期升高，S期下降，凋亡率增加。但AG1478作用不如TAM明顯，兩者聯(lián)合應(yīng)用，作用更強(qiáng)(P＜0.

12、05)。對(duì)于T-MCF-7細(xì)胞，TAM阻滯作用不明顯，而AG1478的作用要強(qiáng)于TAM，兩者聯(lián)合應(yīng)用作用更好(P＜0.05)。進(jìn)一步證明了EGFR信號(hào)通路在TAM耐藥細(xì)胞中的重要作用。 [結(jié)論]ER(+)乳腺癌細(xì)胞，在給予ER拮抗劑TAM處理以后，通過(guò)一定的介導(dǎo)途徑，增加了細(xì)胞EGFRmRNA和EGFR蛋白表達(dá)水平，提高了EGFR介導(dǎo)的Ras/Raf/MAPK和PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性，使乳腺癌細(xì)胞對(duì)TAM產(chǎn)生抵抗性。

13、耐藥的乳腺癌細(xì)胞對(duì)EGFR抑制劑更加敏感。結(jié)果提示EGFR信號(hào)通路在乳腺癌細(xì)胞對(duì)TAM耐藥形成過(guò)程中有重要作用。同時(shí)，為針對(duì)EGFR的靶向治療提供了依據(jù)。 3、表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑對(duì)乳腺癌裸鼠模型的作用研究 [目的]研究表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)抑制劑AG1478對(duì)乳腺癌裸鼠模型的作用，及與三苯氧胺(TAM)聯(lián)合使用的治療效果，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。 [材料和方法]近交系BALB/c裸鼠(雌性，4～5周齡，SP

14、F級(jí)，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)30只，接種乳腺癌細(xì)胞MCF-7(中國(guó)科學(xué)院上海生化細(xì)胞所)成瘤后，體積在100～150mm3時(shí)平均分成5組：溶劑組(C組)、DMSO組(D組)、TAM組(T組)、AG1478組(A組)和TAM+AG1478組(T+A組)。給藥方法及劑量：C組空白溶劑50μl/只/次，每日一次灌胃；D組DMSO40μl/只/次，兩日一次腹腔注射；T組TAM5mg/kg/d(50μl)每日一次灌胃；A組AG14784

15、00μg/只/次(40μl)兩日一次腹腔注射；T+A組同時(shí)給予TAM和AG1478，劑量和方法同上。連續(xù)6周給藥，觀察腫瘤體積變化。用藥結(jié)束后兩天處死裸鼠，切取腫瘤，記錄裸鼠體重、腫瘤體積和重量，計(jì)算抑瘤率；切取部分腫瘤組織作FCM和Wsternblot試驗(yàn)。 [結(jié)果]各組裸鼠體重和腫瘤體積在治療前具有均衡性。連續(xù)用藥6周，腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)顯示對(duì)照組腫瘤生長(zhǎng)最快，A組次之，T組腫瘤生長(zhǎng)較慢，而T+A組腫瘤有縮小趨勢(shì)。用藥結(jié)束后平均腫

16、瘤體積(mm3)：C組552.6±171.5，A組379.7±38.8，T組243.8±49.5，T+A組¨7.6±37.8。平均瘤重(g)：C組0.88±0.22，A組0.57±0.19，T組0.41±0.13，T+A組0.23±0.11.平均抑瘤率：A組35.2﹪，T組53.4﹪，T+A組73.9﹪。各治療組與對(duì)照組比較差異有顯著性(P＜0.05)。 FCM結(jié)果顯示A組對(duì)細(xì)胞周期的影響和T組相似，都可使G0/G1期細(xì)胞比例升

17、高，S期及G2/M期細(xì)胞降低，增殖指數(shù)下降，細(xì)胞凋亡率升高。但A組的影響作用不如T組強(qiáng)，T+A組的影響最明顯。各組與對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05) Westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，T組的EGFR總量有所增加，與對(duì)照組比較差異有顯著性(P＜0.05)，但與A組和T+A組比較，差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。ERK1/2蛋白在各組的表達(dá)水平基本一致。但是，p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平在T組是增加的，在A組和T+A組是下降