大鼠銅缺乏和過量敏感指標篩選及銅鋅生物效應.pdf

1、本論文擬開展以下三個方面的研究工作： 第一部分大鼠銅缺乏和過量敏感生化指標篩選 目的：考察大鼠攝食低銅飼料后的血液生化指標變化及其出現(xiàn)生化指標顯著變化的時間。 方法：選用12只清潔級5周齡S.D雄性大鼠，按體重隨機分為2組，即對照組和缺銅組，分別攝食Cu含量為8.0mg/kg的常規(guī)飼料和銅含量為1.0mg/kg的人工半純合飼料(Semi-purified diet)，所有大鼠均自由攝食和自由飲用去離子水，進行9周

2、的喂養(yǎng)試驗。于試驗的第3和6周剪尾取血，第9周處死并采集大鼠血液樣品，用于測定血漿銅藍蛋白酶活力(PCP)及血漿銅藍蛋白酶含量(PPD值)。 結果：缺銅組大鼠的血漿銅藍蛋白酶活力及血漿銅藍蛋白酶含量極顯著低于對照組(p<0.01)。缺銅組大鼠飼養(yǎng)3周后的血漿銅藍蛋白酶活力極顯著高于第6和9周(p<0.01．)，第6周與第9周差異不顯著(p>0.05)。缺銅組大鼠第3，6和9周血漿中的銅藍蛋白酶含量差異不顯著(p>0.05)。結論

3、：血漿銅藍蛋白酶活力(PCP)對低銅飼料敏感，飼養(yǎng)6周即可顯著降低。大鼠銅缺乏和過量的正式試驗(試驗二)目的：建立缺銅大鼠模型，篩選大鼠銅缺乏和過量的敏感生化指標。方法：選用45只清潔級5周齡S.D雄性大鼠，按體重隨機分為5組(5x9)，作為銅缺乏組(CuD)，銅臨界缺乏組(CuMD)，銅臨界過量組(CuME)，銅過量組(CuE)和對照組(Control)，前4組大鼠飼喂銅含量為0.73mg/kg的半純合基礎飼料；對照組飼喂銅含量為7.

4、0mg/kg的常規(guī)飼料；同時，每天下午按體重的1％分別灌喂銅含量為0，0.033，0.133，0.800和0mg/ml的硫酸銅溶液(銅含量為0組用去離子水灌喂)，所有大鼠均自由進食和自由飲用去離子水，進行6周喂養(yǎng)試驗。在試驗末處死所有大鼠，并采集其血液和內(nèi)臟樣品測定血漿銅藍蛋白酶的活力(PPD值)及其含量(PCP)，紅細胞Cu-Zn超氧化物岐化酶活力(EC Cu-ZnSOD)，肝臟銅(LC)和肝臟金屬硫蛋白(LMT)含量。結果：5項生化

5、指標的總體方差分析表明，飼料銅水平對5項生化指標的影響顯著(p<0.05)。缺銅組大鼠的5項生化指標都極顯著低于對照組(p<0.01)；除銅過量組大鼠的紅細胞銅一鋅超氧化物歧化酶外，缺銅組大鼠的其余4項生化指標也顯著低于其余3個銅處理組(p<0.01)。銅處理組間比較結果如下： 血漿銅藍蛋白酶活力：大鼠血漿銅藍蛋白酶活力隨飼料銅水平的升高而升高，其銅攝入水平與血漿銅藍蛋白酶活力呈顯著正相關(p<0.01)，組間分析表明，大鼠血漿

6、銅藍蛋白酶活力組間兩兩差異顯著(p<0.05)。肝臟金屬硫蛋白：大鼠銅攝入水平與肝臟金屬硫蛋白含量顯著正相關(p<0.01，R<'2>=0.725)，銅過量組肝臟金屬硫蛋白顯著高于缺銅組、銅臨界缺乏組和銅臨界過量組(p<0.05)；銅臨界過量組顯著高于缺銅組(p<0.05)。血漿銅藍蛋白酶含量與銅攝入水平?jīng)]有顯著相關關系，組間比較發(fā)現(xiàn)僅有缺銅組血漿銅藍蛋白酶含量極顯著低于其余各組(p<0.001)。大鼠的肝臟銅含量與銅攝入水平?jīng)]有顯著相

7、關關系，組間比較發(fā)現(xiàn)缺銅組大鼠的肝臟銅含量顯著低于銅過量組、銅臨界缺乏組和銅臨界過量組(p<0.05)。缺銅組大鼠的紅細胞銅．鋅超氧化物歧化酶活力顯著低于銅臨界缺乏組和銅臨界過量組(p<0.05)，與過量組差異不顯著(p>0.05)。 結論：5周齡大鼠經(jīng)過喂飼低銅飼料6周即可成功地建立缺銅模型。血漿銅藍蛋白酶活力是評價大鼠體內(nèi)銅營養(yǎng)狀態(tài)的最敏感指標。 第二部分大鼠銅缺乏和過量的生物效應 目的：觀察分析大鼠銅缺乏和

8、過量的生物效應。 方法：選用45只清潔級5周齡S.D雄性大鼠，動物試驗設計同第一部分，共進行6周喂養(yǎng)試驗。在試驗末每組取5只大鼠的6種內(nèi)臟器官制作切片，光鏡下觀察和分析其組織學變化；測定血清膽固醇、三酰甘油、極低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、IgM和白細胞的含量，分析大鼠骨髓像及骨密度。 結果：缺銅組和過量組大鼠生長異常，都有部分動物死亡。銅水平僅對大鼠心臟重量系數(shù)(心臟/體重的百分比)的影響極顯著(p<0.001)。銅臨界

9、過量組和過量組大鼠的心臟重量系數(shù)極顯著低于銅臨界缺乏組和對照組(p<0.01)；缺銅組大鼠的腦重量系數(shù)(腦重量/體重的百分比)極顯著低于對照組(p<0.01)。大鼠內(nèi)臟組織切片觀察發(fā)現(xiàn)銅缺乏組有60％的大鼠心肌組織和80％大鼠的肺組織有病理變化，主要表現(xiàn)為心肌纖維有斷裂，出現(xiàn)小灶性嗜酸性變；部分缺銅大鼠的肺小動脈肌層肥厚，管腔狹窄閉塞。銅臨界缺乏組中40％大鼠心肌組織有病變，主要表現(xiàn)為冠狀動脈小分枝內(nèi)皮增生，腫脹。銅臨界過量組中40％大

10、鼠的肺組織有病理變化，表現(xiàn)為肺小動脈中層平滑肌層數(shù)增多，壁增厚。銅過量組中有40％大鼠的心肌和肺組織有病理變化，主要表現(xiàn)為心肌纖維核溶解，出現(xiàn)胞肌嗜酸性變“嗜酸性小體”。 各銅處理組間大鼠的骨密度沒有顯著差異(p>0.05)。飼料銅水平對肝臟Fe，Cu含量的影響為極顯著(p<0.01)，對Mg和zn的影響不顯著(p>0.05)；銅缺乏組和臨界過量組大鼠肝臟Fe含量極顯著高于對照組和過量組大鼠(p<0.01)。銅處理組間大鼠的骨髓

11、細胞增生活躍，沒有明顯差異。銅過量組大鼠的紅系統(tǒng)顯著高于缺銅組和銅臨界過量組(p<0.05)。 結論：銅缺乏的生物效應有影響大鼠的生長、顯著降低大鼠腦的重量、損傷大鼠的心臟和肺組織；銅過量的生物效應：影響大鼠的生長、顯著降低大鼠的心臟重量、損傷大鼠的心臟和肺組織、拮抗飼料鐵的吸收和可能促發(fā)大鼠的缺鐵性貧血。 第三部分大鼠攝食不同銅鋅水平飼料的生物效應研究 目的：研究大鼠攝食不同銅鋅水平飼料的生物效應。 方

12、法：36只清潔級5周齡體重為53.9～81.2g的S.D雄性大鼠按體重隨機分為4組，即對照組(Control)、低銅組(LCG)、低鋅組(LZG)和低銅低鋅組(LCLZG)。對照組喂飼生長鼠的常規(guī)飼料；其余三組大鼠喂飼人工半純合基礎飼料。每天下午按體重的1％分別灌喂銅含量為0，0，0．0625和0 mg/ml的硫酸銅溶液(銅含量為0組用去離子水灌喂)。1～4組大鼠攝食的飼料銅，鋅含量分別為7.0，15.0：0.73，15.17；5.73

13、，3.17；0.73，3.17 mg/kg，其Cu/Zn比值為0.5333，0.0481，0.2303，1.8076。所有大鼠均自由進食和自由飲用去離子水，進行6周的飼養(yǎng)試驗。在試驗末處死所有大鼠，采集其血液和內(nèi)臟樣品測定血漿銅藍蛋白酶的含量(PPD值)及其活力(PCP)，紅細胞Cu-Zn超氧化物岐化酶活力(EC Cu-Zn SOD)，肝臟銅(LC)和肝臟金屬硫蛋白(LMT)含量；測定血清膽固醇、三酰甘油、極低密度脂蛋白、高密度脂蛋白和

14、IgM等含量；每組取5只大鼠的6種內(nèi)臟器官制作切片，油鏡下觀察和分析其組織學變化；分析測定大鼠骨髓像及股骨密度。 結果：3個銅鋅處理組大鼠的血漿銅藍蛋白酶活力都極顯著低于對照組大鼠，低銅組大鼠的血漿銅藍蛋白酶活力極顯著低于其余3組(p<0.01)，低鋅組大鼠的血漿銅藍蛋白酶活力顯著高于低銅低鋅組(p<0.05)。低銅組大鼠肝臟金屬硫蛋白含量顯著低于對照組、低鋅組和低銅低鋅組(p<0.01或p<0.05)，低鋅組大鼠肝臟金屬硫蛋白

15、含量顯著高于低銅低鋅組(p<0.05)。低銅組大鼠的紅細胞Cu-Zn SOD酶活力極顯著低于其余3組，低鋅和銅低鋅組大鼠的紅細胞Cu-ZnSOD酶活力極顯著高于對照組大鼠(p<0.01)。低銅組大鼠的肝臟銅含量低于低鋅組，低鋅組大鼠的肝臟銅含量顯著高于低銅低鋅組(p<0.001)。低鋅組和低銅低鋅組大鼠的血清膽固醇，三酰甘油，高密度脂蛋白和IgM含量顯著降低(p<0.05)。低銅低鋅組的大鼠骨髓粒細胞系統(tǒng)和粒紅比顯著高于對照組和低銅組，

16、淋巴細胞顯著低于對照組和低銅組的大鼠(p<0.05)。低銅低鋅組大鼠腎臟、心臟和腦重量系數(shù)顯著低于對照組(p<0.05)；低銅組和低鋅組大鼠的腦重量系數(shù)也顯著低于對照組(p<0.05)。低銅低鋅組和對照組大鼠的組織切片沒有明顯損傷，低鋅組大鼠有輕微的心肌炎，低銅組大鼠心臟和肺組織結構都有損傷。 結論：肝臟金屬硫蛋白和肝臟銅含量與大鼠攝食飼料的銅鋅比值成正相關，血漿銅藍蛋白酶活力及其含量也有隨飼料銅鋅比升高而升高的趨勢，在最高Cu

17、/Zn比值組又呈下降趨勢。低鋅顯著降低了大鼠血漿膽固醇，三酰甘油，高密度脂蛋白和IgM的含量，銅鋅比值降低和升高都會損傷大鼠心肌組織，因此在分析與銅鋅相關疾病時，調(diào)查銅鋅比值比單純銅、鋅絕對含量更有意義。 綜上所述，本課題通過大鼠攝食低銅半純合飼料建立大鼠缺銅模型后，用不同銅水平和不同銅、鋅水平的飼料進行6周喂養(yǎng)大鼠試驗，找到了銅缺乏和銅過量的敏感生化指標，并觀察了其臟器重量和病理改變，骨密度、骨髓像的變化等生物效應，為銅缺乏和