革蘭陰性桿菌AmpC酶的檢測分析及質粒介導AmpC酶耐藥基因研究.pdf

1、本研究旨在通過對河北醫(yī)科大學和白求恩國際和平醫(yī)院2003年3月～2004年3月臨床分離的至少對一種三代頭孢菌素耐藥的革蘭陰性桿菌產(chǎn)生的BLA表型分析，揭示質粒AmpCβ-內(nèi)酰胺酶陽性的革蘭陰性桿菌的流行特點及主要質粒耐藥基因型別。 研究方法： 1.用K-B紙片擴散法檢測細菌耐藥表型特點。 2.采用改良三維試驗方法檢測BLA表型。即用滅菌棉棒蘸取0.5麥氏單位的大腸埃希菌ATCC25922菌液均勻涂抹MH瓊脂平板，

2、10分鐘后于平板中央貼一含30μg頭孢曲松的紙片(Ceffriaxone，CRO)，距紙片邊緣5mm處放射狀打4個長10mm、寬1mm的槽，相鄰兩槽互為直角。分別于槽內(nèi)加45μl粗提酶液+5μl生理鹽水、45μl粗提酶液+5μl氯唑西林(CLO)、45μl粗提酶液+5μl克拉維酸(CLA)、45μl粗提酶液+2.5μl克拉維酸+2.5μl氯唑西林后，置35℃培養(yǎng)24h。以粗提酶液周圍長出細菌，抑菌環(huán)缺損，形成一指向CRO的矢狀菌苔，即為

3、產(chǎn)酶陽性。無矢狀菌苔者為陰性。產(chǎn)酶陽性者，CLO單獨加入時抑制試驗為陽性，即該菌AmpCβ-內(nèi)酰胺酶檢測陽性；CLA單獨加入時抑制試驗為陽性，即該菌ESBLs檢測陽性；CLO或CLA單獨加入不能抑制酶活性(抑酶試驗陰性)，同時加入CLA和CLO時抑酶試驗為陽性，說明該菌同時產(chǎn)生ESBLs和AmpC兩種酶；當同時加入CLA和CLO時抑酶試驗仍為陰性，若被EDTA等抑制，則為金屬β-內(nèi)酰胺酶。此時平板中央須貼一片10μg亞胺培南紙片代替頭孢

4、曲松紙片。若酶不能被酶抑制劑CLA、CLO、EDTA抑制，該菌可能為產(chǎn)非AmpC、ESBLs及金屬酶的其它β-內(nèi)酰胺酶陽性，如耐抑制劑廣譜酶等。以肺炎克雷伯氏菌ATCC700603為ESBLs陽性對照，以陰溝腸桿菌029M為AmpC酶陽性對照，以大腸埃希菌ATCC25922為陰性對照。 3.對AmpCβ-內(nèi)酰胺酶(含同時產(chǎn)ESBLs和AmpC兩種酶者)陽性株用堿裂解法提取細菌質粒，進行轉化試驗，再次提取轉化子質粒，以兩種質粒作模

5、板，設計5對5群基因型(CMY-1、CMY-2、DHA、ACT、FOX)引物，進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定，并取陽性擴增產(chǎn)物回收，測序。以大腸埃希菌ATCC25922為陰性對照，試劑盒所攜帶的陽性模板為陽性對照。 研究結果： 1.受試236株革蘭陰性桿菌中共有29株產(chǎn)酶陽性，產(chǎn)酶率為12.3％。其中單純產(chǎn)AmpCβ-內(nèi)酰胺酶17株，陽性率為7.2％；單純產(chǎn)ESBLs8株(3.4％)；AmpCβ-內(nèi)酰胺酶和ESB

6、Ls均陽性2株(0.8％)；2株為非高產(chǎn)AmpC酶、ESBLs、金屬酶(0.8％)。因此共檢出產(chǎn)AmpCβ-內(nèi)酰胺酶菌株19株，檢出率為8.1％。未發(fā)現(xiàn)金屬酶陽性株。 2.19株AmpC酶陽性菌株對常用抗生素呈現(xiàn)多重耐藥性。除對亞胺培南和頭孢吡肟全部敏感外，對其它各類藥物均呈現(xiàn)不同程度的耐藥。對氨基青霉素耐藥率為89.5～100％；第三代頭孢菌素的耐藥率為68.4～9.5％；氨曲南耐藥率為78.9％；氨基糖苷類為68.4～78.

7、9％；氟喹諾酮類為73.7～84.2％。其耐藥率明顯高于非產(chǎn)酶株的耐藥率，約為1.2-2.44倍(P＜0.05)。 3.19株產(chǎn)AmpCβ-內(nèi)酰胺酶陽性株分別為大腸埃希菌(36.8％)；肺炎克雷伯菌(26.3％)；陰溝腸桿菌、鮑曼不動桿菌(各15.8％)及粘質沙雷氏菌(5.3％)。來源于痰標本(47.4％)；燒傷創(chuàng)面分泌物(21.1％)。主要來自老年病房(31.5％)、呼吸內(nèi)科(26.3％)、燒傷科(21.1％)。以患重癥肺炎(

8、42.1％)；大面積燒傷(21.1％)；惡性腫瘤(10.5％)的病人為主要易感人群。 4.產(chǎn)質粒AmpCβ-內(nèi)酰胺酶菌株的轉化株保留了對頭孢西丁、三代頭孢菌素的耐藥性，對四代頭孢菌素及碳青酶烯類亞胺培南的敏感性與臨床分離株相近。 5.19株AmpCβ-內(nèi)酰胺酶陽性的革蘭陰性桿菌質粒耐藥基因型結果為：5株DHA-1型陽性，2株ACT-1陽性，未發(fā)現(xiàn)CMY-1、CMY-2、FOX陽性株，13株5種基因型均陰性。源于含耐藥基因

9、臨床菌株的轉化株也同時檢測到了該耐藥基因，更加有力地說明耐藥基因是存在于質粒上的。耐藥基因分別檢出于大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌及陰溝腸桿菌。6對DHA-1和ACT-1基因擴增產(chǎn)物經(jīng)測序，與GenBank上的DHA-1和ACT-1基因序列完全相同。 研究結論： 1.應用改良三維試驗方法檢測革蘭陰性桿菌的產(chǎn)酶表型，在實際工作中是切實可行的。 2.本組資料顯示臨床分離出的菌株中產(chǎn)AmpCβ-內(nèi)酰胺酶的菌株陽

10、性率為8.1％。以前多側重ESBLs的檢測，對AmpCβ-內(nèi)酰胺酶的研究較少，應引起高度重視。 3.產(chǎn)質粒介導AmpCβ-內(nèi)酰胺酶的細菌耐藥率比較高，對頭孢西丁及第一、二、三代頭孢菌素均耐藥?？晒┡R床經(jīng)驗用藥選擇的只有四代頭孢菌素如頭孢吡肟和碳青酶烯類如亞胺培南等。 4.產(chǎn)質粒介導的AmpCβ-內(nèi)酰胺酶的陽性株主要來源于痰及燒傷分泌物，以老年病房、呼吸科及燒傷科為主，重癥肺炎、惡性腫瘤、燒傷病人為主要易感人群。