產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶的肺炎克雷伯菌耐藥性及新基因、整合子研究.pdf

1、目的：
　　 了解安徽省2007年臨床分離的180株肺炎克雷伯菌產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC β-內(nèi)酰胺酶的情況及產(chǎn)酶菌株的耐藥性。
　　 研究產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC β-內(nèi)酰胺酶陽性菌株的耐藥基因型別的分布。
　　 研究新型質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶的分子生物學(xué)特性及Ⅰ類整合子的檢測定位。
　　 材料和方法：
　　 收集安徽省細菌耐藥監(jiān)控網(wǎng)中的33家醫(yī)院2007年9月（9月1日到30日）從臨床標(biāo)本（去除同一病例相同部

2、位重復(fù)分離的菌株）中分離的肺炎克雷伯菌180株，采用全自動微生物分析儀對標(biāo)本進行重新鑒定。
　　 經(jīng)頭孢西丁紙片法試驗初篩出產(chǎn)AmpC酶菌株，對初篩陽性的細菌，采用三維試驗篩選。經(jīng)質(zhì)粒提取和多重聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴增攜帶AmpC酶菌株基因，陽性菌株進一步行全編碼引物PCR擴增，將全編碼區(qū)PCR擴增產(chǎn)物按Sanger雙脫氧末端終止法，用自動測序儀對其進行測序以鑒定基因型。對其中測序證實有基因突變的菌株行克隆測序。并用瓊脂平板稀

3、釋法測定AmpC陽性菌株對17種抗菌藥物的耐藥性。
　　 將一株攜帶新酶全編碼基因的細菌轉(zhuǎn)移結(jié)合到受體菌E.Coli J53中，接合子用含100mg/L的疊氮納和2mg/L頭孢西丁的LB瓊脂平板篩選。采用Southern Blotting試驗再次驗證新酶是否由質(zhì)粒介導(dǎo)并定位其編碼基因所在質(zhì)粒的大小。
　　 將新酶全編碼基因克隆入表達載體pHSG398，轉(zhuǎn)化于感受態(tài)細胞E.coli JM109，用加有抗菌藥物的瓊脂平板進行

4、轉(zhuǎn)化株篩選。用瓊脂平皿稀釋法對野生株、接合子與轉(zhuǎn)化株同時進行MIC測定。
　　 采用超聲破碎法進行產(chǎn)新酶細菌轉(zhuǎn)化株的粗酶提取，粗酶純化后，等電聚焦電泳測定其pI。SDS-PAGE和考馬斯藍染色測定新酶分子量大小，進行酶促反應(yīng)動力學(xué)研究，以初步了解新酶的動力學(xué)特性。
　　 同時對該突變菌株及其結(jié)合子行Ⅰ類整合子保守序列的擴增及測序，并采用Southern Blotting試驗驗證Ⅰ類整合子保守序列是否由質(zhì)粒介導(dǎo)并定位其編碼

5、基因所在質(zhì)粒的大小。
　　 結(jié)果：
　　 180株肺炎克雷伯菌經(jīng)目的基因測序后確證產(chǎn)AmpC酶的菌株有21株，占11.67％。其中DHA型19株，EBC型4株，有3株檢出新基因(GenBank登錄號為FJ237366，F(xiàn)J237367，F(xiàn)J237368)；藥敏結(jié)果顯示產(chǎn)酶株均為多重耐藥，除亞胺培南與美羅培南外，對三、四代頭孢菌素，氨基糖苷類及喹諾酮類均有不同程度的耐藥性。
　　 突變株K.pneumonia E7

6、01經(jīng)轉(zhuǎn)移接合實驗及Southern雜交證實其攜帶的AmpC酶全編碼基因為質(zhì)粒介導(dǎo)。新型質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶的耐藥譜未發(fā)生顯著變化。新酶全編碼基因經(jīng)克隆表達，提酶純化后，等電點測定為8.4，且酶對頭孢西丁有高水解率。這種等電點為8.4的酶的活性不能被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制。
　　 突變株Ⅰ類整合子保守序列的擴增測序解釋了其對氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥性，Southern雜交證實Ⅰ類整合子位于同樣大小的質(zhì)粒上。
　　 結(jié)論：