東北細毛羊胎羊卵巢卵泡發(fā)育及體外培養(yǎng)研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、羊的產仔性能介于單胎動物和多胎動物之間,其卵巢卵泡發(fā)育的研究有助于從理論上對動物生殖生理進一步認識,也為提高動物的繁殖力奠定理論基礎。充分了解羊卵泡發(fā)生和卵母細胞成熟,對合理改進超排技術和充分利用卵巢卵母細胞資源具有重要意義。 在動物轉基因等研究中,可供分子水平進行操作的雌性生殖系細胞除了有受精卵、早期胚胎及胚胎干細胞之外,胚胎期生殖細胞也是一類可供分子水平操作的細胞,目前已經越來越受到人們的重視。如外源DNA導入的生殖細胞,如

2、果能夠利用導入外源基因的胚胎期卵巢生殖細胞與卵巢體細胞重新構建形成卵泡/卵巢,經過卵巢移植,直接使受體動物排出帶有外源基因的卵母細胞,將為轉基因動物的生產提供新的方法。另外,卵泡體外重組和卵巢移植也可為臨床治療卵巢疾病提供新的思路。所以,目前對胚胎期卵巢發(fā)育的研究已經愈顯重要。 哺乳動物卵巢內的原始卵泡庫是雌性生殖資源的儲存庫,反芻動物(牛、羊)在胎兒時期形成并發(fā)育,但大部分卵泡在腔前階段退化閉鎖了,這無疑是對這一資源的巨大浪費

3、,隨著生物技術的蓬勃發(fā)展,對可利用卵母細胞的需求日益增加,單純依靠超排技術或卵母細胞體外成熟技術已不能滿足日益增長的商業(yè)和研究目的的需要,因此有越來越多的學者致力于腔前卵泡的研究,并在了解了腔前卵泡的結構的基礎上,建立了一系列腔前卵泡培養(yǎng)體系。但以上這些研究大多是以出生后、特別是性成熟的動物作為實驗材料。胎兒期較系統(tǒng)的研究未見報道。 本實驗以東北細毛羊胎羊卵巢為研究材料,對不同胎齡的東北細毛羊胎羊卵巢卵泡發(fā)育的組織學、超微結構和

4、酶細胞化學進行了系統(tǒng)地研究,了解和掌握了胎羊卵泡和卵母細胞的發(fā)育規(guī)律;進而,建立了一套有效的胎羊卵巢腔前卵泡的采集方法,并對發(fā)育不同階段的卵泡及卵母細胞進行了體外培養(yǎng)的初步探索,為充分利用腔前卵泡資源奠定了理論和實踐基礎。 實驗結果表明: 1.胚胎卵巢重量與胚胎長度、胚胎重量、卵巢體積擬合的回歸方程:Y4=6.357+0.088Y1+0.004Y2+13.707Y3其中Y1為胚胎長度(cm);Y2為胚胎重量(g);Y3為

5、卵巢體積(ml)Y4為卵巢重量(mg)。 2.東北細毛羊胎羊卵巢髓質組織結締化程度逐漸增大,血管不斷增多、變粗和向四周擴展,至20周時,已占據卵巢中央的大部分區(qū)域,把皮質推壓到較窄的邊緣區(qū)域。胎羊卵巢10周齡左右髓質與皮質分界模糊,到12周齡左右分界明顯,21周齡左右形成了完整的皮質和髓質。 3.隨著胎羊的生長發(fā)育,卵原細胞在逐漸減少,而卵母細胞在不段地增加。到21周齡左右基本完成了卵母細胞的儲備。 4.胎羊卵巢

6、10周齡左右出現(xiàn)原始卵泡;12周齡左右出現(xiàn)由原始卵泡向初級卵泡過渡的中間類型;14周齡左右規(guī)則的單層立方卵泡細胞的初級卵泡出現(xiàn);18周齡發(fā)現(xiàn)了次級卵泡。 5.18周齡左右胎羊卵巢卵泡卵母細胞出現(xiàn)透明帶;20周齡左右胎羊卵巢卵母細胞被3~4層顆粒細胞包圍時,形成了一薄層較完整的透明帶。20周齡左右胎羊卵巢卵泡卵母細胞出現(xiàn)了三級卵泡,21周齡左右發(fā)現(xiàn)大腔卵泡(葛拉夫氏卵泡)。 6.卵泡窩存在于胎羊卵巢發(fā)育的整個過程中,以三種

7、形式存在:即多卵原細胞構成的卵泡窩、多卵母細胞構成的卵泡窩及多卵原細胞和多卵母細胞共同構成的卵泡窩。 7.在胎羊卵巢中,發(fā)育早期存在由許多卵原細胞構成的復合體;多卵原細胞或多卵母細胞或二者共同構成的小復合體,存在于胎羊卵巢發(fā)育整個過程中。 8.胎羊卵巢原始卵泡的形成過程 一種形式:卵原細胞分裂成初級卵母細胞后,外周被來自卵巢基質的細胞包圍,即形成單卵初級卵泡細胞的卵泡;另一種形式:首先卵原細胞不斷、快速地有絲分裂

8、,被多層梭形細胞完整包圍,形成大的卵原細胞復合體,然后,又分裂成許多小的復合體,最后,卵原細胞分裂為初級卵母細胞(1個或數(shù)個),卵泡細胞侵入,形成原始卵泡。 9.胎羊卵巢在卵巢發(fā)育各階段都有一定數(shù)量卵母細胞發(fā)生退行性變化—閉鎖。 10.胎羊卵巢卵泡卵母細胞堿性磷酸酶,主要定位在卵母細胞質膜上。胚胎早期,核的代謝活動強烈,隨著胎兒生長,代謝活動減弱,而細胞膜的代謝活動恰好相反。 11.酸性磷酸酶,主要定位于溶酶體上

9、。隨著胎兒的發(fā)育,胎羊卵巢卵泡卵母細胞上酸性磷酸酶不斷增多,即卵母細胞退化逐漸增加。 12.用機械-酶消化法分離不同發(fā)育階段的胎羊卵巢腔前卵泡最適宜的膠原酶濃度是0.06%(w/v)(含膠原酶約120消化單位/mL)。分離12周齡左右的胎羊腔前卵泡所獲得的原始卵泡數(shù)量比其它時期分離的要多,分離獲得初級卵泡的最佳時間是在20周齡左右。隨著胎齡增加,分離所得正常卵泡率逐漸增加。 13.在本培養(yǎng)體系中,0.6IU/mlPMSG

10、處理組對胎羊腔前卵泡體外48h培養(yǎng)效果最好。在培養(yǎng)的過程中,腔前卵泡活率隨培養(yǎng)時間延長而逐漸下降。20、21周齡左右胎羊卵巢腔前卵泡體外培養(yǎng)72h,體積明顯大于其它培養(yǎng)各組,腔前卵泡培養(yǎng)活率也顯著高于其它培養(yǎng)各組,21周齡左右胎羊腔前卵泡活率可達38.98%。 14.胎羊腔前卵泡體外培養(yǎng),原始卵泡可以發(fā)育到初級卵泡;初級卵泡多數(shù)能發(fā)育到次級卵泡階段,少數(shù)能發(fā)育到有腔卵泡初期的體積;次級卵泡部分能發(fā)育到早期腔卵泡體積,絕少數(shù)出現(xiàn)了

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