靶向白介素15受體的免疫毒素對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療作用的研究.pdf

1、目的：IL-15及其受體(IL-15R)的表達(dá)異常是許多炎癥性自身免疫疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素。前期工作中我們構(gòu)建了兩個靶向IL-15R陽性細(xì)胞的免疫毒素IL15-PE△293和IL15M-PE△293，它們分別以人IL-15和IL-15受體拮抗劑(IL-15M)為載體基團(tuán)，效應(yīng)基團(tuán)均為綠膿桿菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)突變體PE△293。本研究將這兩種融合蛋白進(jìn)行表達(dá)純化，明確兩種融合蛋白對IL-15R陽性細(xì)胞的

2、靶向性以及對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動物模型的體內(nèi)治療效果，從而對它們的臨床應(yīng)用前景作出部分分析評價。
　　 方法：將這兩種融合蛋白的重組質(zhì)粒pET-hIL-15-PE△293和pET-hIL-15M-PE△293分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21(DE3)plysS，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)可溶性表達(dá)，在非變性條件下利用Ni2+-NTA親和層析法進(jìn)行純化。將兩種融合蛋白分別以兩種濃度(0.1nM和1nM)同IL-15受體(IL-15R)陽性細(xì)胞

3、K562進(jìn)行孵育，通過免疫熒光染色方法分析兩種藥物的靶向特異性。將兩種PE類免疫毒素IL15-PE△293和IL15M-PE△293分別以兩種不同濃度(20pM和200pM)與IL-15R陽性細(xì)胞(K562)進(jìn)行孵育，流式分析這兩種PE類免疫毒素對靶細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。以大鼠佐劑關(guān)節(jié)炎為人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)動物模型，通過對各治療組大鼠關(guān)節(jié)炎臨床指標(biāo)以及組織病理方面的分析，來研究兩種導(dǎo)向藥物對于IL-15/IL-15R異常表達(dá)相關(guān)的炎

4、癥性自身免疫性疾病的在體治療效果。通過免疫組化實驗對大鼠關(guān)節(jié)組織的T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分子標(biāo)記(CD4、CD68)以及炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)進(jìn)行分析，并通過實時定量PCR技術(shù)對炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-15和MMP3的分子水平表達(dá)情況進(jìn)行分析。利用免疫印跡法檢測關(guān)節(jié)炎大鼠IL-15信號通路組份STAT3的磷酸化水平，分析IL15-PE△293和IL15M-PE△293治療前后STAT3磷酸化水平的變化情況。

5、
　　 結(jié)果：從大腸桿菌可溶性蛋白中純化出兩種融合蛋白。兩種融合蛋白在兩個作用濃度下(0.1nM和1nM)均能夠與靶細(xì)胞K562結(jié)合并進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，而不能與IL-15R陰性細(xì)胞Jurkat結(jié)合。兩種融合蛋白在兩種濃度下(20pM和200pM)均能夠刺激K562細(xì)胞的凋亡，并且隨著藥物濃度的增加靶細(xì)胞的凋亡率也有所增加，但在誘導(dǎo)凋亡效率方面兩種融合蛋白之間沒有明顯的差異。兩種融合蛋白可以明顯減輕關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)組織炎癥細(xì)胞的浸潤，減

6、輕關(guān)節(jié)病變，抑制炎癥因子IL-1β、TNF-α和MMP3的表達(dá)，但兩種融合蛋白在治療效果上沒有明顯差異。有趣的是，兩種融合蛋白不能抑制炎癥細(xì)胞因子IL-15的mRNA表達(dá)。在IL15M-PE△293及IL15-PE△293治療前后IL-15信號通路成員STAT3的磷酸化水平?jīng)]有發(fā)生顯著變化。
　　 結(jié)論：(1)兩種靶向毒素能夠緩解RA炎癥細(xì)胞的浸潤及減少軟骨和骨組織的破壞，能夠抑制炎癥細(xì)胞因子IL-1β，TNF-c和金屬蛋白酶3