惡性腫瘤基因工程納米疫苗抗腫瘤轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)作用的研究.pdf

1、惡性腫瘤危害巨大，但惡性腫瘤的三大傳統(tǒng)療法－手術(shù)、放療和化療，治療效果不盡人意。隨著對(duì)腫瘤免疫理論的深入認(rèn)識(shí)和一些新的實(shí)驗(yàn)方法的涌現(xiàn)，腫瘤疫苗已成為預(yù)防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的有力手段。但由于機(jī)體免疫網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性、腫瘤異質(zhì)性、疫苗生物利用度差等問題，使得現(xiàn)有腫瘤疫苗的免疫效果并不理想。黑色素瘤抗原（Melanoma Antigen，MAGE）是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的人類腫瘤特異性抗原，MAGE3 是MAGE 家族的重要成員之一，在多種不同類型惡性

2、腫瘤中均有表達(dá)，在正常組織細(xì)胞（除睪丸、胎盤外）不表達(dá)；且MAGE3 可與人類白細(xì)胞抗原（Human Leukocytes Antigen，HLA）分子結(jié)合形成抗原復(fù)合物，此抗原復(fù)合物可被細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（Cytotoxic T Lymphocyte，CTL）的T 細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）所識(shí)別，誘導(dǎo)特異性CTL 的殺傷作用，是腫瘤特異性免疫治療理想的靶分子。 熱休克蛋白（Heat Shock Pr

3、otein，HSP）具有分子伴侶作用，參與腫瘤抗原的加工遞呈，在誘導(dǎo)腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用；本室研究表明，HSP70與MAGE3 融合蛋白能提高M(jìn)AGE3 蛋白疫苗的免疫效果。納米載藥系統(tǒng)與傳統(tǒng)載藥系統(tǒng)相比有很多優(yōu)點(diǎn)，可有效解決蛋白質(zhì)藥物的生物利用度差的問題，目前已經(jīng)有許多深入而廣泛的研究。 本研究以納米脂質(zhì)體包裹腫瘤特異性抗原MAGE3 與熱休克蛋白HSP70的融合蛋白（MH），制備出納米脂質(zhì)體疫苗NL（MH），著重對(duì)其

4、抗腫瘤轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)作用進(jìn)行研究，為該納米疫苗臨床前研究奠定基礎(chǔ)。 一. 納米脂質(zhì)體疫苗制備 目的：制備無明顯毒性、高效的惡性腫瘤基因工程納米疫苗。 方法：純化融合蛋白MH，薄膜分散－超聲法制備包裹MH 的納米脂質(zhì)體腫瘤疫苗NL（MH），并評(píng)價(jià)其粒徑、包裹率及穩(wěn)定性；觀察NL（MH）免疫組小鼠的急性毒性反應(yīng)，及重要臟器的病理學(xué)改變。 結(jié)果：①成功制備出粒徑為80±25nm 的納米脂質(zhì)體，其藥物包裹率為30％，

5、于4℃放置6 個(gè)月后或3000rpm 10分鐘離心后無分層，證明其穩(wěn)定性良好；②與PBS 對(duì)照組相比，免疫組小鼠未見明顯毒性反應(yīng)。 結(jié)論：該惡性腫瘤基因工程納米疫苗具有良好的理化性質(zhì)，未見毒性反應(yīng)。 二. 納米疫苗預(yù)防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)效應(yīng)研究 目的：在小鼠體內(nèi)觀察納米疫苗預(yù)防和治療腫瘤肺轉(zhuǎn)移及預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)的作用。 方法：以PBS、空白脂質(zhì)體、MH、MH /NL、NL（MH）免疫C57BL/6小鼠3 次

6、后，IFN-γ ELISPOT 和LDH 殺傷試實(shí)驗(yàn)檢測(cè)納米疫苗激活小鼠特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)的情況；以實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移模型和自然肺轉(zhuǎn)移模型評(píng)價(jià)納米疫苗預(yù)防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移作用；以腫瘤攻擊實(shí)驗(yàn)和腫瘤切除后復(fù)發(fā)實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)納米疫苗預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)作用。 結(jié)果：與其它組相比，NL（MH）組小鼠脾淋巴細(xì)胞中分泌IFN-γ的T 細(xì)胞數(shù)量明顯增多（P<0.05），CTL 對(duì)B16-MAGE3細(xì)胞具有顯著的特異性殺傷作用；在預(yù)防和治療腫瘤肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)中，與其

7、它組小鼠相比，NL（MH）免疫組小鼠B16-MAGE3 腫瘤肺臟轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)明顯減少（P<0.05）；在腫瘤攻擊實(shí)驗(yàn)中，NL（MH）組B16-MAGE3 腫瘤成瘤時(shí)間長、成瘤率低；腫瘤切除后復(fù)發(fā)實(shí)驗(yàn)中，NL（MH）組B16-MAGE3 腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)間延遲，復(fù)發(fā)率明顯降低。 結(jié)論：NL（MH）能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的MAGE3 特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)，對(duì)表達(dá)MAGE3 的腫瘤細(xì)胞具有顯著的殺傷作用，能有效預(yù)防和治療B16-MAGE3 腫瘤