甲型流感病毒NP基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其免疫效果研究.pdf

1、目的: 流行性感冒(簡(jiǎn)稱流感)是由甲(A)、乙(B)、丙(C)三型流感病毒分別引起的急性呼吸道感染，其中甲型流感病毒在自然界中廣泛分布，常以流行形式出現(xiàn)，可引起世界性流感大流行，對(duì)人類健康和世界經(jīng)濟(jì)造成巨大影響。流感病毒在自然界中不僅能經(jīng)常發(fā)生抗原性漂移，而且也能發(fā)生同型毒株間基因片段的重配，這樣就造成了流感疫苗的時(shí)效性。因此，研制具有交叉保護(hù)能力的流感疫苗對(duì)于有效防止流感的發(fā)生和流行具有重要意義。 甲型流感病毒RNA分

2、為8個(gè)節(jié)段，其中第5節(jié)段編碼其核衣殼蛋白(nucleoprotein，NP)。NP參與病毒復(fù)制周期的多個(gè)階段，影響病毒的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、裝配及轉(zhuǎn)運(yùn)功能；此外，NP也是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic Tlymphocytes.CTL)識(shí)別的主要抗原，CTL通過(guò)識(shí)別MHC-I類分子遞呈的核蛋白抗原肽而清除感染的流感病毒，因而能對(duì)不同亞型的病毒株產(chǎn)生交叉保護(hù)性。 本研究旨在構(gòu)建pcDNA3.1(+)/NP的核酸疫苗，觀察其在真核細(xì)

3、胞中的表達(dá)，并在機(jī)體水平上研究其單獨(dú)應(yīng)用及與本室成功構(gòu)建的pcDNA3.1(+)/HA聯(lián)合應(yīng)用的抗流感病毒免疫效果。 方法: 1.甲型流感病毒NP基因DNA疫苗的構(gòu)建：從流感病毒株A/PR/8/34(H1N1)感染的雞胚尿囊液中提取病毒RNA，用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增NP基因，并將擴(kuò)增的NP基因克隆入真核表達(dá)載體pcDNA 3.1(+)，構(gòu)建NP基因的真核表達(dá)載體-pcDNA3.1(+)/NP。 2.pcDNA3.

4、1(+)/NP的初步表達(dá)：將pcDNA3.1(+)/NP質(zhì)粒DNA用脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，然后用免疫熒光檢測(cè)重組質(zhì)粒的表達(dá)情況。再將pcDNA3.1(+)/NP質(zhì)粒DNA經(jīng)肌肉注射免疫動(dòng)物，免疫組化技術(shù)檢測(cè)NP基因在肌細(xì)胞的表達(dá)及持續(xù)時(shí)間。 3.pcDNA3.1(+)/NP質(zhì)粒DNA的免疫效果研究：將pcDNA3.1(+)/NP質(zhì)粒DNA采用DNA疫苗的肌肉注射方式免疫動(dòng)物，通過(guò)免疫檢測(cè)技術(shù)觀察其對(duì)機(jī)體的抗流感病毒免

5、疫應(yīng)答；并用同一亞型流感病毒攻擊免疫小鼠，觀察肺指數(shù)和肺指數(shù)抑制率等指標(biāo)；最后用不同亞型的流感病毒攻擊免疫小鼠，觀察保護(hù)率。綜合評(píng)價(jià)pcDNA3.1(+)/NP作為DNA疫苗的保護(hù)效果，和與pcDNA3.1(+)/HA聯(lián)合應(yīng)用的免疫效果。 結(jié)果: 1.經(jīng)RT-PCR技術(shù)從流感病毒RNA中擴(kuò)增到.NP基因，經(jīng)酶切后插入pcDNA3.1(+)，構(gòu)建成pcDNA3.1(+)/NP。該重組載體經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切、：PCR及序列測(cè)

6、定等鑒定，證實(shí)pcDNA3.1(+)/NP構(gòu)建成功。 2.pcDNA3.1(+)/NP質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染ItEK293細(xì)胞后，免疫熒光結(jié)果顯示所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞有較強(qiáng)的綠色熒光信號(hào)。給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肌肉內(nèi)注射pcDNA3.1(+)/NP質(zhì)粒DNA后，在實(shí)驗(yàn)觀察的所有時(shí)間點(diǎn)均可觀測(cè)到NP蛋白的表達(dá)。 3.淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)表明，動(dòng)物接種pcDNA3.1(+)/NP質(zhì)粒DNA后，在流感病毒抗原的刺激下，能夠誘導(dǎo)有效的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。流感病毒

7、攻擊后肺指數(shù)等指標(biāo)顯示，pcDNA3.1(+)/NP質(zhì)粒DNA與pcDNA3.1(+)/HA質(zhì)粒DNA聯(lián)合使用對(duì)抑制肺病變程度的效果顯著。被pcDNA3.1(+)/Np質(zhì)粒DNA免疫的動(dòng)物對(duì)同亞型流感病毒攻擊的保護(hù)率為50％，對(duì)不同亞型流感病毒攻擊的保護(hù)率為37.5％，而且與pcDNA3.1(+)/HA質(zhì)粒DNA聯(lián)合使用后可明顯提高保護(hù)率。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建了甲型流感病毒NP基因的真核表達(dá)載體-pcDNA3.1(+)

8、/NP。 2.免疫熒光技術(shù)證實(shí)了NP基因能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肌肉注射該重組質(zhì)粒DNA后可在肌細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到目的基因表達(dá)。 3.淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)證實(shí)，pcDNA3.1(+)/NP的質(zhì)粒DNA免疫動(dòng)物后能有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗流感病毒的細(xì)胞免疫。pcDNA3.1(+)/NP的質(zhì)粒DNA免疫動(dòng)物后，對(duì)同一亞型和/或不同亞型流感病毒的攻擊都能提供有效的保護(hù)作用，與pcDNA3.1(+)/HA聯(lián)合應(yīng)用可明顯提高保護(hù)效果。