hTPO抗原決定簇?zé)狳c(diǎn)區(qū)基因原核表達(dá)及臨床應(yīng)用.pdf

1、人甲狀腺過(guò)氧化物酶(humanThyroidPeroxidase，簡(jiǎn)稱(chēng)hTPO)是人體甲狀腺激素合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，同時(shí)也是自身免疫性甲狀腺疾病(AutoimmuneThyroidDisease，簡(jiǎn)稱(chēng)AITD)患者體內(nèi)的一種主要自身抗原活性物質(zhì)之一，對(duì)其抗體的檢測(cè)對(duì)自身免疫性甲狀腺疾病，尤其是橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto'sThyroiditis，簡(jiǎn)稱(chēng)HT)的診斷有重要意義。 目的：利用分子生物學(xué)方法在原核系統(tǒng)表達(dá)hTPO

2、抗原決定簇片段，以基因工程產(chǎn)品為抗原，建立hTPO抗體檢測(cè)的ELISA定性及定量方法，并用于臨床作為AITD的診斷和療效監(jiān)測(cè)手段。 方法：將本室構(gòu)建的hTPO抗原決定簇“熱點(diǎn)”區(qū)基因(1702-2622，編號(hào)相對(duì)于起始密碼，編碼AA568-874)的重組表達(dá)質(zhì)粒pGESJ轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株E.ColiBL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)純化獲得GST-hTPO融合蛋白，并對(duì)其進(jìn)行分子量和免疫活性鑒定。以GST-hTPO為抗原，以ELISA方法

3、檢測(cè)臨床甲狀腺疾病患者血清內(nèi)hTPO抗體水平。 結(jié)果：1.GST-TPO融合蛋白的表達(dá)及純化以E.ColiBL21為表達(dá)菌株，以IPTG(isopropylβ-D-thoiglactoside,異丙基β-D-硫代半乳糖苷)為誘導(dǎo)劑，濃度1mM，25℃誘導(dǎo)5.5小時(shí)，產(chǎn)物經(jīng)GlutathioneSepharose4B親和層析純化后，使用SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳)測(cè)定GST-hTPO分子量結(jié)果為61.24KD，經(jīng)

4、考馬斯亮藍(lán)染色法定量獲得融合蛋白表達(dá)產(chǎn)率為5mg/L培養(yǎng)基，ELISA結(jié)果證明GST-hTPO具有良好免疫活性，且GST與甲狀腺球蛋白(Thyroglobulin,簡(jiǎn)稱(chēng)Tg)無(wú)交叉反應(yīng)。 2.以融合蛋白GST-hTPO為抗原建立定性及定量ELISA方法檢測(cè)患者血清中的TPO-Ab 反應(yīng)條件的優(yōu)化：按交叉連續(xù)稀釋法組合包被抗原量，人血清稀釋倍數(shù)，二抗稀釋倍數(shù)，結(jié)果在不同條件組合中當(dāng)包被抗原量為1μg/孔，人血清稀釋倍數(shù)為1

5、：1，二抗稀釋倍數(shù)為1；20000時(shí)，37℃顯色45分鐘時(shí)陽(yáng)性血清與陰性血清的OD值差距最大(陽(yáng)性血清值為陰性血清值二倍以上)，故選作最佳條件。方法的重復(fù)性：樣品批內(nèi)變異系數(shù)為5.51％和6.75％，批間變異系數(shù)為8.95和9.51％。 3.臨床應(yīng)用以O(shè)D值大于1.127為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，用此方法測(cè)定病人血清hTPO抗體，GD初診患者陽(yáng)性率為10.4％(26/249例)，橋本氏甲狀腺炎患者陽(yáng)性率為79％(26/33例)，亞急性甲狀腺炎