ApoA-I介導泡沫細胞內(nèi)膽固醇流出過程中的相關分子鑒定.pdf

1、[目的]
　　 在動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，As)發(fā)生發(fā)展過程中，泡沫細胞的形成是早期關鍵性事件。巨噬細胞來源的泡沫細胞形成是動脈粥樣損傷形成的特征表現(xiàn)。促使膽固醇從巨噬細胞中外流對阻止泡沫細胞形成以及防止動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展具有重要意義。膽固醇以囊泡轉(zhuǎn)運進行分泌已經(jīng)得到公認，而在此過程中有高密度載脂蛋白-Ⅰ(apolipoprotein，apoA-Ⅰ)的介導，SCAMP2和YKT6是囊泡分泌蛋白，參與囊

2、泡分泌轉(zhuǎn)運，那么在apoA-Ⅰ介導的巨噬細胞源性泡沫細胞內(nèi)膽固醇流出過程中是否有這兩種蛋白的參與，目前未見報道。本研究首先建立巨噬細胞源性泡沫細胞模型，采用高效液相色譜(HPLC)檢測apoA-Ⅰ介導泡沫細胞內(nèi)膽固醇流出的變化，在此基礎上分析在apoA-Ⅰ介導的細胞內(nèi)膽固醇流出過程中，SCAMP2和YKT6表達的變化，鑒定在此途徑中是否有SCAMP2和YKT6參與。
　　 [方法]
　　 1.人單核THP-1細胞用含10

3、％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，佛波酯(PMA)誘導人單核THP-1細胞，使其分化為巨噬細胞，然后加入乙?；兔芏戎鞍?ac-LDL)，使巨噬細胞進一步誘導為泡沫細胞，建立巨噬細胞源性泡沫細胞模型。
　　 2.巨噬細胞源性泡沫細胞經(jīng)多聚甲醛固定，油紅O染色，加蘇木精復染，于相差顯微鏡下觀察，對巨噬細胞源性泡沫細胞模型進行簽定。
　　 3.細胞分為巨噬細胞組、泡沫細胞組和加apoA-Ⅰ處理的泡沫細胞組，分別收集

4、各組細胞和培養(yǎng)基，并分別提取膽固醇，以膽固醇標準品為對照，高效液相色譜法(HPLC)檢測各組的膽固醇含量，計算膽固醇流出率。
　　 4.細胞培養(yǎng)誘導成泡沫細胞后，根據(jù)SCAMP2和YKT6基因在GenBank中的序列設計、合成引物，通過RT-PCR半定量和Real-time PCR定量方法，分別分析巨噬細胞、泡沫細胞和apoA-Ⅰ處理的泡沫細胞中SCAMP2和YKT6基因表達。
　　 5.Western blotting

5、方法分析巨噬細胞、泡沫細胞和加apoA-Ⅰ處理的泡沫細胞中SCAMP2和YKT6蛋白表達。
　　 [結果]
　　 1.經(jīng)油紅O染色鑒定，成功建立了巨噬細胞源性泡沫細胞模型。
　　 2.高效液相色譜法(HPLC)檢測顯示，加入apoA-Ⅰ介導了泡沫細胞內(nèi)膽固醇的流出，其流出率變化為5.9％。
　　 3.RT-PCR、Real-time PCR分析表明，與對照泡沫細胞相比，加入apoA-Ⅰ后泡沫細胞內(nèi)SCAM

6、P2基因表達量分別增加1.18倍和1.7倍；YKT6基因表達量分別增加1.2倍和1.9倍。
　　 4.Western blotting分析證實了在apoA-Ⅰ介導泡沫細胞膽固醇流出過程中，與acLDL組相比，SCAMP2和YKT6蛋白表達量分別增加1.2倍和1.6倍。
　　 [結論]
　　 在apoA-Ⅰ介導的泡沫細胞內(nèi)膽固醇流出過程中，囊泡轉(zhuǎn)運蛋白SCAMP2和YKT6基因和蛋白表達都有升高，首次證實了囊泡轉(zhuǎn)運