退變椎間盤炎性因子介導細胞凋亡以及整合素α5β1轉(zhuǎn)導力學信號研究.pdf

1、本論文以力學因素為主要干預手段對大鼠尾椎間盤干預，運用核磁共振(MRI)、TUNEL法、RT-PCR法、免疫熒光定量、流式細胞儀、共聚焦顯微鏡、Western Blot等各種方法對椎間盤退變的相關(guān)指標進行檢測，本研究共包括三個部分。
　　 第一部分大鼠尾椎間盤退變模型建立及影像學、組織形態(tài)學變化
　　 目的：建立一種新型力學因素誘導的大鼠尾椎間盤退變模型，通過影像和組織學觀測驗證模型的可靠性。
　　 方法：24只

2、SD大鼠，隨機分為對照組和實驗組，每組12只，實驗組大鼠用3.6％水合氯醛腹腔麻醉（10ml/Kg），安裝外固定架并按等同大鼠體重力量加壓，對照組不安裝外固定架。兩組分別于術(shù)前全部及術(shù)后2、4、8周各隨機抽取4只大鼠行MRI檢查，測量矢狀面T2WICo7～8、Co8～9和Co9～10椎間盤髓核MEANS值，采用椎間盤MRI評價標準進行退變程度分度。在MRI檢查后，麻醉處死大鼠，取Co7～8、Co8～9和Co9～10椎間盤組織塊，甲醛固定

3、，HE染色、膠原蛋白免疫組化檢測。
　　 結(jié)果：MRI檢查：對照組椎間盤TIWI中低信號，T2WICo8～9髓核呈高信號。實驗組術(shù)后2周T2WICo8～9髓核信號降低，MEANS值降低。術(shù)后4周T2WI椎間隙變窄，Co8～9髓核信號明顯降低，MEANS值明顯降低。術(shù)后2、4、8周實驗組與對照組T2像上Co8～9髓核MEANS值比較均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。HE染色：對照組見髓核細胞數(shù)量多、排列均勻，纖維環(huán)各層排列整齊。實驗

4、組Co8～9在術(shù)后2周見髓核細胞減少，纖維環(huán)排列紊亂。術(shù)后4周髓核細胞進一步減少，出現(xiàn)成維樣細胞。8周髓核幾乎被纖維軟骨組織替代，纖維環(huán)排列不整齊，與髓核界限不清。免疫組化：對照組Co8～9髓核組織中Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原染色呈規(guī)整網(wǎng)狀。實驗組Co8～9髓核和纖維環(huán)術(shù)后4周、8周與對照組相比，Ⅱ型膠原染色變淺，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)破壞。
　　 結(jié)論：在國內(nèi)首次構(gòu)建了外固定架固定應力型椎間盤退變模型并首次采用MRI對鼠尾椎間盤退變進行觀測。與國外

5、同類模型相比，外固定架固定四節(jié)段椎間盤退變模型消除了椎間盤退變的營養(yǎng)因素影響，為研究椎間盤退變的機理及治療方法提供了好的模型。
　　 第二部分退變椎間盤組織中IL-1β、MMP-2的表達與p38介導髓核細胞凋亡
　　 目的：通過對大鼠退變尾椎間盤組織中IL-1β、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）表達的研究，探討IL-1β、MMP-2在椎間盤退變中的作用及其與p38介導髓核細胞凋亡的相關(guān)性。
　　 方法：椎間盤組織

6、HE染色：術(shù)后4周，對照組和實驗組各隨機抽取5只大鼠，過量麻醉處死，迅速取出Co8～9椎間盤組織（分離髓核和纖維環(huán)），甲醛溶液固定24h。標本經(jīng)脫鈣、脫水、透明、浸蠟、包埋后切片。TUNEL標記檢測細胞凋亡：術(shù)后4周，兩組各隨機取5只大鼠，取出Co8～9椎間盤髓核和纖維環(huán)，TUNEL標記檢測細胞凋亡。Quantitative Real-time PCR檢測IL-1β、MMP-2、CollagenⅡ基因：4周時兩組各隨機選15只，取出Co

7、8～9椎間盤髓核和纖維環(huán)，用PBS反復沖洗后立即置于Trizol溶液中用于熒光定量RT-PCR檢測。Western Blot檢測p38蛋白及其磷酸化水平：術(shù)后4周，兩組各隨機取大鼠5只，取Co8～9椎間盤髓核和纖維環(huán)，蛋白免疫印跡檢測細胞內(nèi)p38蛋白及其磷酸化水平。
　　 結(jié)果：實驗組Co8～9術(shù)后4周可見髓核細胞密度增加，胞外基質(zhì)減少，纖維環(huán)排列紊亂。髓核細胞發(fā)生凋亡，凋亡指數(shù)為0.29，細胞凋亡指數(shù)兩組之間有統(tǒng)計學差異(P＜

8、0.05)。實驗組髓核組織IL-1β的mRNA水平與對照組相比升高2.63±0.33倍(P＜0.05)，纖維環(huán)組織IL-1β的mRNA水平升高8.50±0.16倍(P＜0.05)；實驗組髓核組織MMP-2的mRNA水平與對照組相比則升高8.87±0.24倍(P＜0.05)；與對照組相比，CollagenⅡ在髓核和纖維環(huán)中下降至0.15±0.09倍和0.44±0.17倍(P＜0.05)。實驗組髓核組織p38蛋白含量表達與對照組比較無明顯差

9、異。p38蛋白磷酸化水平明顯升高，p-p38/β-actin比值對照組僅0.12±0.02，而實驗組比值達0.63±0.05，兩者之間有明顯差異(P＜0.05)。椎間盤發(fā)生退變后p38蛋白磷酸化水平提高，p38蛋白活性增強。
　　 結(jié)論：退變的椎間盤髓核細凋亡明顯增加，胞外基質(zhì)成分減少。實驗組椎間盤組織中IL-1β的含量明顯高于正常組椎間盤組織，進一步證實了IL-1β參與椎間盤的退變過程。此外，發(fā)現(xiàn)IL-1β表達量與MMP-2有

10、相關(guān)性，說明IL-1β在椎間盤退變過程中與MMP-2相互作用，共同促進組織退變。在國內(nèi)首次證實退變椎間盤髓核細胞中p38MAPK蛋白磷酸化水平明顯增高，蛋白活性增強，誘導凋亡。
　　 第三部分退變椎間盤整合素α5β1的表達及力學信號轉(zhuǎn)導
　　 目的：在應力加壓型椎間盤退變模型中，研究椎間盤組織內(nèi)整合素α5β1的表達、活化情況、檢測其下游信號分子變化，探討力學信號經(jīng)整合索α5β1轉(zhuǎn)導的可能機制。
　　 方法：免疫組

11、織化學檢測組織中整合素α5定位及定量表達：術(shù)后4周，兩組各隨機抽取3只大鼠，過量麻醉處死，迅速取出Co8～9椎間盤組織（分離髓核和纖維環(huán)，下同），甲醛溶液固定24h。石蠟切片采用免疫組化法檢測整合素α5定位及定量表達，切片光鏡觀察。免疫熒光檢測組織細胞表面整合素α5定位表達：術(shù)后4周，兩組各隨機抽取2只大鼠，麻醉處死，迅速取出Co8～9椎間盤組織、固定、漂洗、孵育、滴加特異性一抗、二抗、漂洗、DAPI復染細胞核、核甘油磷酸緩沖液封片，熒

12、光顯微鏡下鏡觀察。流式細胞計數(shù)檢測細胞表面整合素α5β1定量表達：術(shù)后4周，兩組各隨機抽取15只大鼠，麻醉處死，迅速取出Co8～9椎間盤組織，并用眼科剪剪碎至糊狀懸液，加入0.25%胰蛋白酶和0.2%膠原蛋白酶適量，消化組織懸液。通過尼龍網(wǎng)過濾成單細胞懸液。離心后加入50ml緩沖液重懸細胞后計數(shù)，需要時予臺盼藍(Trypan Blue)檢測細胞活性。采用間接標記的一抗，加入整合素α5抗體，并加入FITC二抗冰上孵育，細胞熒光染色。Qua

13、ntitative Real-time PCR檢測整合素α5β1基因：術(shù)后4周，兩組各隨機抽取5只大鼠，麻醉處死，迅速取出Co8～9椎間盤組織，細胞總RNA用IRIzol抽提，以oligo dT為引物，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR green
　　 方法進行實時定量PCR。Western Blot檢測FAK及其磷酸化水平：術(shù)后4周，兩組各隨機取5只大鼠，取Co8～9椎間盤髓核和纖維環(huán)。蛋白免疫印跡檢測細胞內(nèi)FAK及其磷酸化水平

14、。
　　 結(jié)果：免疫組化染色顯示對照組髓核細胞表面有大量整合素α5表達，分布較均勻；實驗組加壓4周后，退變的椎間盤髓核細胞散在分布，細胞表面染色不均。免疫熒光檢測見兩組髓核和纖維環(huán)細胞膜上均有整合素α5表達，實驗組表達減少、熒光強度減弱。流式細胞計數(shù)檢測細胞表面整合素α5β1定量表達，在實驗組髓核和纖維環(huán)組織流式細胞計數(shù)平均熒光強度下降，與對照組相比有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。實驗組髓核組織整合素α5的mRNA水平與對照組相比

15、略升高，纖維環(huán)組織整合素α5稍下降；實驗組髓核和纖維環(huán)組織整合素β1的mRNA水平比對照組略升高。但各組之間mRNA變化水平均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。實驗組髓核組織FAK蛋白含量表達與對照組比較無明顯差異。實驗組FAK蛋白磷酸化水平明顯升高，p-FAK/β-actin比值對照組為0.15±0.07，而實驗組比值0.42±0.11，兩者有明顯差異(P＜0.05)。實驗組椎間盤發(fā)生退變后p-FAK(FAK-Y397)表達明顯高于對照組