γδT細胞免疫治療骨肉瘤的臨床前研究.pdf

1、骨肉瘤為兒童和青少年最常見的原發(fā)惡性骨腫瘤，約占原發(fā)性骨惡性腫瘤的20％和惡性腫瘤的0.5％。隨著新輔助化療的應用，對于局部肢體骨肉瘤患者生存率得到明顯改善，5年生存率已上升到65％～75％。但對于發(fā)生肺轉(zhuǎn)移和局部復發(fā)的骨肉瘤患者預后極差，至今尚無有效方法。
　　 免疫治療是繼手術、化療之后，治療骨肉瘤的綜合治療手段之一。γδT細胞是人體內(nèi)固有免疫中的一個重要T細胞群；表現(xiàn)為CD4-CD8-“雙陰性”表型，對抗原的識別無MHC限

2、制性，無需抗原提呈細胞提呈；具有確鑿的廣譜殺滅腫瘤細胞功能。然而，γδT細胞對骨肉瘤的作用目前研究較少。在本次研究中，我們探討了γδT細胞免疫治療骨肉瘤的作用及可能涉及的途徑。
　　 本次研究主要分三部分：一、首先以健康人和骨肉瘤患者外周血單個核細胞為研究對象，應用Zol和IL-2聯(lián)合刺激，獲得高純度的γδT細胞擴增。重要的是該方法獲得的γδT細胞具有細胞毒性。二、在第一部分實驗的基礎上，我們探索了γδT細胞及與唑來膦酸聯(lián)合抗骨

3、肉瘤細胞的能力與途徑，結果發(fā)現(xiàn)γδT細胞具有抗骨肉瘤能力，并且與唑來膦酸聯(lián)合效果更好。三、在裸鼠中建立骨肉瘤的動物模型，觀察了γδT細胞在動物模型中對骨肉瘤的作用。結果發(fā)現(xiàn)γδT細胞具有抑制骨肉瘤增殖能力，并且與唑來膦酸聯(lián)合效果更好。我們的研究結果表明，γδT細胞具有抗骨肉瘤的作用。
　　 第一部分γδT細胞的制備及殺傷活性
　　 目的：
　　 建立外周血單個核細胞體外擴增γδT細胞的方法。
　　 方法：

4、
　　 不同來源的外周血單核細胞分別使用IL-2和Zol+IL-2刺激體外擴增，流式細胞技術檢測γδT細胞的純度，以Daudi細胞作為陽性對照、Raji細胞為陰性對照，并以人成骨細胞系hFOB細胞作為正常對照，用LDH法檢測擴增后γδT細胞的細胞毒活性。
　　 結果：
　　 健康人和骨肉瘤患者外周血單核細胞經(jīng)過體外14天的培養(yǎng)，Zol+IL-2組可高度選擇性擴增γδT細胞，并且擴增后γδT細胞具有殺傷活性，而對正

5、常細胞無殺傷活性。
　　 結論：
　　 在體外，Zol和IL-2刺激外周血單個核細胞可以高度選擇性擴增γδT細胞。
　　 第二部分γδT細胞殺傷骨肉瘤細胞的體外研究
　　 目的：
　　 探討γδT細胞及其聯(lián)合唑來膦酸在體外殺傷骨肉瘤細胞的活性及其識別和殺傷骨肉瘤細胞的途徑。
　　 方法：
　　 應用LDH法檢測不同來源的γδT細胞在體外殺傷骨肉瘤細胞和唑來膦酸預處理骨肉瘤細胞的活性

6、；以ELISA方法檢測γδT細胞和骨肉瘤細胞共培養(yǎng)上清中的IFN-γ；應用不同阻斷劑分別阻斷γδT細胞以觀察其殺傷骨肉瘤細胞的途徑。
　　 結果：
　　 1.不同來源的γδT細胞在體外對骨肉瘤細胞具有一定的殺傷活性，但來源于復發(fā)性和轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者殺傷活性較低；唑來膦酸可顯著增強γδT細胞的殺傷作用。
　　 2.骨肉瘤細胞可刺激γδT細胞分泌IFN-γ。
　　 3.γδT細胞識別、殺傷Zol預處理骨肉瘤細

7、胞主要通過TCR途徑和穿孔素-溶酶途徑，NKG2D途徑和TRAIL途徑發(fā)揮作用較小。
　　 結論：
　　 γδT細胞具有抗骨肉瘤作用。
　　 第三部分γδT細胞的體內(nèi)抑瘤實驗研究
　　 目的：
　　 γδT細胞的體內(nèi)抑瘤活性。
　　 方法：
　　 裸鼠皮下注射骨肉瘤細胞建立腫瘤活體模型，動物分為對照組、單獨Zol組、單獨γδ細胞組和Zol+γδT細胞聯(lián)合治療組，尾靜脈注射途徑接受治