γδT細胞對骨肉瘤細胞株的殺傷作用及分子機制的實驗研究.pdf

1、前言:
　　 骨肉瘤是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤之一,目前采用手術、新輔助化療等綜合治療方案后,仍有30％～40％的骨肉瘤患者發(fā)生遠處轉移,免疫治療是繼手術、化療之后,治療骨肉瘤的手段之一。在目前研究的免疫治療方法中,CD8+CTL細胞及經(jīng)典CD3-NK細胞,如腫瘤浸潤淋巴細胞,細胞因子誘導的殺傷細胞等治療骨肉瘤的效果較差,因而在較長一段時間內(nèi),免疫過繼治療的基礎及臨床研究處于相對停滯狀態(tài),而γδ T細胞作為新的具有特異性抗腫瘤活

2、性的免疫細胞,在抗腫瘤方面的潛在作用逐漸為人們所重視。
　　 以往認為γδT細胞為一類不成熟的T細胞,其功能可能與壞死組織的清除有關。但越來越多的研究表明,γδ T細胞具有與CTL及NK細胞相似的殺傷腫瘤細胞及病毒感染細胞的功能,因而在免疫監(jiān)視功能中發(fā)揮了極為重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)γδT細胞對多發(fā)性骨髓瘤、黑色素瘤具有明顯的抗腫瘤作用;γδ T細胞在體內(nèi)的增殖后,能夠大量浸潤至轉移性腎臟腫瘤中,滅殺和清除腫瘤細胞。更為有意義的是,

3、研究證明在人體外增殖后的γδ T細胞對骨肉瘤細胞系具有一定的抑制作用。但迄今為止,γδT細胞在體內(nèi)外如何殺滅骨肉瘤細胞及其具體的作用機制未見報道。
　　 目的:
　　 探討骨肉瘤患者與正常人外周血單個核細胞中γδ T細胞比例的差異以及γδ T細胞對骨肉瘤細胞的殺傷作用及其可能的分子機制。
　　 方法：
　　 通過密度梯度離心法從10例骨肉瘤患者、5例骨肉瘤肺轉移患者和10例正常人外周血中分離出單個核細胞后

4、,應用流式細胞儀檢測γδ T細胞所占的比例。外周血中分離出的單個核細胞在體外經(jīng)唑來膦酸刺激后,用含白介素-2培養(yǎng)基培養(yǎng)14天,再次用流式細胞儀測定γδT細胞的比例。
　　 按一定效靶比將γδ T細胞和骨肉瘤細胞(MG63、U2OS、SAOS)體外混合培養(yǎng)4小時后,用乳酸脫氫酶釋放法檢測γδ T細胞對骨肉瘤細胞的殺傷作用。并用抗人。NKG2D抗體和抗人TCR-γδ-PE抗體阻斷γδ T細胞相關通路后,再次測定γδT細胞對骨肉瘤細胞

5、的殺傷作用。最后用ELISA法檢測γδ T細胞和骨肉瘤細胞(按效靶比1:20)混合培養(yǎng)8、12、24、48、72后上清液中IFN-γ和TNF-α的含量。
　　 統(tǒng)計學處理用SPSS15.0軟件完成,計量資料數(shù)據(jù)表示方式以平均值±標準差(Mean±SD),組間計量資料采用非獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學顯著性意義。
　　 結果：
　　 骨肉瘤患者組和骨肉瘤肺轉移患者組外周血單個核細胞中γδT細胞的比例顯

6、著低于正常組。外周血中分離出單個核細胞在體外經(jīng)唑來膦酸刺激后,用含白介素-2的培養(yǎng)基中,培養(yǎng)14天,γδ T細胞的比例能達到95％以上,且各組之間γδT細胞的比例無明顯差異。
　　 γδ T細胞對不同骨肉瘤細胞系都有明顯的殺傷作用,在體外骨肉瘤患者的γδ T細胞對骨肉瘤細胞的殺傷作用與正常人無明顯差異。用抗人NKG2D和抗人TCR-γδ-PE抗體分別阻斷γδ T細胞的相關途徑后,發(fā)現(xiàn)γδ T細胞對骨肉瘤細胞的殺傷作用減弱-γδ

7、T細胞和骨肉瘤細胞(按效靶比1:20)混合培養(yǎng)24小時后,測得上清液中IFN-γ的含量明顯增加,而TNF-α則增加不明顯。
　　 結論：
　　 骨肉瘤患者組及骨肉瘤肺轉移患者組外周血單個核細胞中γδ T細胞的比例明顯低于正常組,可能與在骨肉瘤患者體內(nèi)γδ T細胞的增殖功能受到抑制相關;在體外γδ T細胞對骨肉瘤細胞有較強免疫殺傷作用,且骨肉瘤患者與正常人無明顯差異,其機制與γδT細胞表面NKG2D和TCR-γδ受體介導的