大腸桿菌O157-H7新分子伴侶的預(yù)測、表達、純化及其相互作用蛋白的初步篩選.pdf

1、EHEC O157:H7是一種重要的危害嚴重的腸道致病菌,它主要通過III型分泌系統(tǒng)(type III secretion system,TTSS)將毒力蛋白直接注入宿主細胞發(fā)揮致病作用,是許多革蘭氏陰性致病菌中存在的復(fù)雜的分子裝置。TTSS分子伴侶是TTSS的組成部分,對底物(效應(yīng)蛋白或轉(zhuǎn)位蛋白)分泌非常重要。目前在EHEC O157:H7中鑒定的效應(yīng)蛋白與其它病原菌相比少了很多,而且已知效應(yīng)蛋白的作用也無法解釋EHEC O157:H

2、7所導(dǎo)致的復(fù)雜的病理反應(yīng)。
　　為深入探討EHEC O157:H7的致病機制,我們從所有病原菌基因數(shù)據(jù)庫中提取有關(guān)TTSS序列數(shù)據(jù),進行同源分析、模體分析以及基因定位分析,預(yù)測出2個EHEC O157:H7可能的新分子伴侶(編碼基因ecs4553,ecs4563),并對其三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測分析,結(jié)果表明其二級結(jié)構(gòu)均以α螺旋為主,符合TTSS分子伴侶的共同特征并進一步展開實驗驗證預(yù)測結(jié)果可靠性。
　　利用PCR方法從EHEC O

3、157:H7基因組中擴增出新預(yù)測分子伴侶基因ecs4553,并構(gòu)建在表達載體pET-28a(+)、pET-24a(+)上,在E.coli BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達,經(jīng)SDS-PAGE和Western blot檢測結(jié)果表明,成功實現(xiàn)了融合蛋白His6-Ecs4553-His6,Ecs4553-His6,His6-Ecs4553的高效表達。His6-Ecs4553通過Ni2+親和層析柱純化;Ecs4553-His6以包涵體形式表達,重組

4、表達蛋白經(jīng)純化,復(fù)性后獲得了純度為93.5％的目的蛋白;免疫新西蘭大耳白兔制備了抗Ecs4553-His6的多克隆抗體,抗血清的ELISA效價達1:409,600,產(chǎn)生的抗體具有良好的免疫反應(yīng)性,能夠特異性識別基因工程表達的Ecs4553-His6蛋白。
　　PCR擴增了新預(yù)測分子伴侶基因ecs4563,并構(gòu)建在表達載體pET-28a(+)、pET-24a(+)上,重組載體轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)中IPTG誘導(dǎo)表達,

5、經(jīng)SDS-PAGE和Western blot檢測結(jié)果表明,成功實現(xiàn)了融合蛋白His6-Ecs4563-His6,Ecs4563-His6,His6-Ecs4563的高效表達。His6-Ecs4563主要以可溶形式表達,采用Ni2+親和層析純化,獲得純度大于90％的目的蛋白;Ecs4563-His6以可溶形式表達,通過Ni2+親和層析純化,并制備了多克隆抗體，Western blot檢測抗體具有良好的免疫反應(yīng)性,Ecs4563-His6的

6、兔抗血清的免疫擴散效價為1:64。
　　我們用pull down的方法從EHEC O157:H7全菌蛋白中篩選到了與Ecs4563-His6及His6-Ecs4563相互作用的蛋白質(zhì),為ecs4200基因編碼的FKBP型肽酰-脯氨酰-順反式異構(gòu)酶(旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶)和ecs4208基因編碼的cAMP-調(diào)控蛋白。
　　本研究克隆表達并純化了新預(yù)測分子伴侶Ecs4553,Ecs4563,并初步篩選到了Ecs4563的相互作用蛋白,為下