動態(tài)觀測應(yīng)用血清腫瘤標志物及熒光素酶構(gòu)建的前列腺癌仿生化模型的相關(guān)研究.pdf

1、報告指出，美國2010年有191533例前列腺癌新發(fā)病例和26329例死亡病例，超過肺癌，居男性腫瘤之首。近年來，我國前列腺癌的發(fā)病率明顯上升，伴隨著人口老齡化，環(huán)境變化，體檢意識的增強等原因，我國前列腺癌患者必將進一步增加。我國前列腺癌患者必將進一步增加，成為威脅老年男性第一殺手。雖然手術(shù)治療能有效地控制早期局限性前列腺癌，但是許多患者沒能重視，很少復查，最終導致復發(fā)。盡管臨床上常用ADT(ADT)作為晚期前列腺癌的姑息性治療方式。然

2、而，ADT只能延緩腫瘤的進展，最終，多數(shù)患者不可避免的會發(fā)展到激素非依賴性前列腺癌，而對多種內(nèi)分泌藥物產(chǎn)生耐藥甚至抵抗而繼續(xù)進展，侵犯周圍組織及遠處轉(zhuǎn)移，繼而引起患者的死亡。此外，由于前列腺癌患者年齡大，基礎(chǔ)疾病較多，往往因為其他相關(guān)疾病引起相應(yīng)癥狀而不具備充分的身體素質(zhì)去耐受細胞毒性藥物及化療藥物所帶來的副作用。因此，迫切需要深入探討進展性前列腺癌的發(fā)展及轉(zhuǎn)移機制，并評估新的治療手段對腫瘤免疫方面的效應(yīng)機制。
　　 動物模型是

3、進一步研究前列腺癌的發(fā)展、轉(zhuǎn)移機制、腫瘤與宿主免疫效能、評估腫瘤治療措施有效性的重要工具。目前，國內(nèi)外關(guān)于前列腺癌動物模型的研究甚多，但是這些模型仍不能準確模擬人類前列腺癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移的全過程，存在主要問題是:1）對腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的分子生物學事件尚未闡明;2）缺乏研究腫瘤與宿主相互作用的工具;3）反映人腫瘤分子生物學多樣性的模型不足。國內(nèi)外關(guān)于結(jié)合腫瘤血清標志物等多途徑的觀察腫瘤生長、轉(zhuǎn)移情況的研究尚少，且實驗小鼠通常是重度

4、免疫功能缺陷的SCID小鼠或者裸鼠，無法分析腫瘤免疫學相關(guān)指標。
　　 因此，本研究適時地利用了基因工程相關(guān)技術(shù)，結(jié)合血清腫瘤標志物及報告基因系統(tǒng)，構(gòu)建出一個免疫功能健全的前列腺癌小鼠皮下種植模型，通過對其活體的觀察及檢測外周血腫瘤標志物的變化情況，評估腫瘤生長的過程，并利用流式細胞學技術(shù)探究模型的免疫相關(guān)指標的變化情況，為前列腺癌免疫機制的研究和免疫耐受機制的研究提供了很好的工具。
　　 目的:結(jié)合熒光實時成像和血清學

5、腫瘤標記技術(shù)，構(gòu)建一個可供評價免疫機制及生物學功能的小鼠前列腺癌動物模型。
　　 方法:質(zhì)粒構(gòu)建:根據(jù)GenBank中表達人PSA蛋白的KLK3基因序列(GI:22208990)、Luc基因(GI:13195703)設(shè)計聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物，由上海英濰捷基有限公司合成。通過RT-PCR、PCR擴增及酶切連接技術(shù)，分別擴增出KLK3基因序列及l(fā)uc基因序列，并以pIRES元件為模板載體，分別將擴增出luc及KLK3基因連接于

6、pIRES的上游和下游，酶切位點分別為XhoⅠ、MluⅠ和XbaⅠ、SalⅠ，與相應(yīng)酶切的pIRES-KLK3質(zhì)粒連接，構(gòu)建出Luc-pIRES-KLK3質(zhì)粒，質(zhì)粒提取后PCR驗證無誤，并送公司測序鑒定（北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司）。
　　 質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和鑒定:Luc-pIRES-KLK3質(zhì)粒測序正確后擴大培養(yǎng)，lipo2000穩(wěn)定轉(zhuǎn)染小鼠前列腺癌細胞株RM-1，采用G418單克隆篩選法得到穩(wěn)定表達的單克隆株RM1-luc-p

7、IRES-KLK3。大量克隆培養(yǎng)該細胞株，用200ug/ml的G418壓力培養(yǎng)基維持一個月穩(wěn)定培養(yǎng)。
　　 熒光定量PCR(qRT-PCR)及Western blot鑒定PSA蛋白的表達:qRT-PCR:提取總RNA，電泳驗證其完整性，逆轉(zhuǎn)錄完成定量PCR，繪制熔解曲線及擴增曲線，并設(shè)置對照組，進行相對表達量的對比;Western blot:標準的Bradford法進行蛋白定量，SDS-PAGE凝膠電泳，分離后的蛋白被轉(zhuǎn)移到PV

8、DF膜上，室溫封閉1小時，一抗為抗PSA單克隆抗體(santa crus，1∶1000)，4度孵育過夜，HRP標記的兔抗鼠IgG作為二抗(santa crus，1∶1000)室溫封閉1小時后，加入ECL化學發(fā)光試劑置于暗盒中用X片膠片曝光檢測。
　　 體外發(fā)光強度檢測:取96孔板一塊，分為8組，每組7個孔，吸取混合均勻的RM1-luc-pIRES-KLK3細胞2×105個，倍比稀釋，每個孔的細胞數(shù)減半到第6孔，最后1孔中僅加入R

9、M-1細胞作為空白對照，除單加細胞的孔，其他孔內(nèi)于熒光顯像前10分鐘加入熒光素酶底物luciferin100ul，終濃度為150μg/mL。靜置3 min，然后在IVIS100成像系統(tǒng)上檢測發(fā)光情況并拍照記錄。
　　 動物模型的構(gòu)建:小鼠腫瘤體積大小觀察測定及活體熒光成像:取對數(shù)生長期RM1-luc-IRES-KLK3細胞，DPBS制成密度為2.0×106個/ml細胞懸液，加入到5mg/ml的基底膜基質(zhì)中，混勻備用。C57BL/

10、6小鼠均飼養(yǎng)在層流架中，SPF級別，采用10％水合氯醛合劑按300 mg/kg劑量腹腔注射麻醉，于小鼠背側(cè)部皮下注射100ul，約2×105個細胞。分別于注射后第1周、第2周、4周、8周時觀察小鼠皮下腫瘤生長情況，并游標卡尺記錄腫瘤體積大小情況，同時通過IVIS100小動物活體成像系統(tǒng)實時觀測小鼠活體熒光強度及有無微轉(zhuǎn)移灶等情況，顯像前15分鐘按150 mg/kg腹腔注射熒光素底物D-luciferin(PerbioScience Ne

11、derland)。
　　 小鼠外周血PSA測定及外周血免疫學分析:PSA測定采用取眼內(nèi)眥血法分別取得每只小鼠約0.2ml全血離心后得到約0.1ml血漿將標本置于儀器Achitect i2000中用Total PSA檢測試劑對其進行定量分析;另于第7天和第21天的時候，取小鼠眼內(nèi)眥血液樣品分析小鼠外周血中MDSC細胞(CD11b+、GR-1+)及T調(diào)節(jié)細胞(CD4+、Foxp3+)，隨腫瘤生長進展的變化情況。
　　 記錄小

12、鼠存活時間，于第8周對所有小鼠安樂死，取皮下腫瘤及肝臟、腦、肺等組織進行HE染色、免疫組化檢查。
　　 統(tǒng)計學分析:全部數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計軟件SPSS13.0處理，計量資料以陽性率表示，計數(shù)資料比較選用Pearson卡方檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier法，兩組之間的均數(shù)比較采用未配對t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義，p＜0.01表示差異有顯著統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果:成功構(gòu)建出Luc-pIRES-KLK3質(zhì)粒，

13、酶切電泳鑒定分析無誤，測序公司測序驗證KLK3及l(fā)uc基因的插入。
　　 穩(wěn)定細胞株構(gòu)建及鑒定:利用G418單克隆篩選法成功篩選出RM1-luc-pIRES-KLK3單克隆細胞株，并用qRT-PCR的方法從基因水平上鑒定該細胞特有的PSA的表達，繼而Western blot蛋白水平上檢測出PSA蛋白的表達體外熒光成像檢測:通過IVIS100成像系統(tǒng)觀察該細胞系，確定存在熒光素酶的表達，且表達水平的高低與細胞數(shù)量呈正相關(guān)。

14、　　 小鼠荷瘤模型:皮下接種2×105個RM1-luc-pIRES-KLK3細胞數(shù)，1周后所有小鼠100％可見成瘤，并穩(wěn)定表達PSA。在細胞接種后的第1、2、4、8周分別檢測外周血血清中PSA水平及IVIS動態(tài)成像系統(tǒng)中熒光定量分析，結(jié)合游標卡尺測量小鼠皮下腫瘤的體積大小情況，結(jié)果表明小鼠活體腫瘤的熒光強度和腫瘤體積大小呈正相關(guān)(R2=0.937)，同樣的結(jié)果也出現(xiàn)在小鼠活體腫瘤的熒光強度與PSA水平之間(R2=0.988)，同時分析

15、表明，腫瘤體積大小與PSA水平呈正相關(guān)(R2=0.908)。外周血流式細胞學分析結(jié)果表明，隨著腫瘤生長，MDSC細胞和Treg細胞數(shù)量出現(xiàn)了相應(yīng)變化，表達CD4+、Foxp3+免疫細胞Treg所占淋巴細胞百分比(7.35％ vs.9.62％; p=0.0001)呈上升的趨勢，表達CD11b+、Gr-1+的MDSC細胞同樣也在增長(1.93％ to3.02％，p=0.002)。最終HE染色確認了小鼠皮下腫塊為前列腺癌并相關(guān)轉(zhuǎn)移瘤。