5-氟胞嘧啶熱化療對(duì)鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移治療機(jī)理研究.pdf

1、腫瘤自殺基因治療又稱藥物敏感基因療法、分子化療或病毒介導(dǎo)的酶解前藥療法(VDEPT)，其原理是將一些病毒或細(xì)菌基因組中前藥轉(zhuǎn)換酶基因(也叫自殺基因)導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，該基因編碼特殊的酶，可將原先對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞無毒性的前藥在腫瘤細(xì)胞中代謝為毒性產(chǎn)物，從而引起這些細(xì)胞自殺；而在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移自殺基因治療中最長(zhǎng)用的是胞嘧啶脫氨酶(CD)基因，可以將無化療作用的5-氟胞嘧啶(5-FC)轉(zhuǎn)化為5-氟尿嘧啶(5-FU)，從而殺死結(jié)腸癌細(xì)胞，大量細(xì)胞實(shí)驗(yàn)已

2、經(jīng)證明CD/5-FC系統(tǒng)的作用，而且聯(lián)合溫?zé)岑煼ㄐЧ用黠@；但單純CD基因表達(dá)無靶向性，我們將由癌胚抗原(CEA)啟動(dòng)子(TRS)驅(qū)動(dòng)表達(dá)胞嘧啶脫氨酶(CD)基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(G1CEACDNa)導(dǎo)入結(jié)腸癌細(xì)胞，在TRS的作用下CD基因只在CEA陽性的結(jié)腸細(xì)胞中表達(dá)，而正常組織細(xì)胞CEA為陰性，CD基因不會(huì)表達(dá)，從而避免了正常組織受5-FU的化療損傷，提高了基因治療的靶向性，前期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了轉(zhuǎn)染G1CEACDNa的結(jié)腸癌LoV

3、o細(xì)胞比轉(zhuǎn)染CD基因的LoVo細(xì)胞對(duì)5-FC的敏感性提高了19倍；在本次實(shí)驗(yàn)中，我們用成功轉(zhuǎn)染G1CEACDNa的結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞(LoVo-CEACD)建立結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型，用5-FC腹腔熱化療來探討組織特異性胞嘧啶脫氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)系統(tǒng)對(duì)裸鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的治療作用，通過靶向基因治療和熱療來提高5-FC化療的效果，為結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移自殺基因治療提供新的途徑。 我們將質(zhì)粒G1CEACDNa在感受態(tài)細(xì)菌中大量擴(kuò)增

4、，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞，以含G418的RPMI1640培養(yǎng)液篩選培養(yǎng)并擴(kuò)增，RT-PCR檢測(cè)目的基因穩(wěn)定表達(dá)；將15只裸鼠隨機(jī)分為三組，每組5只，分別用門靜脈注射法，脾臟注射法和肝臟注射法建立結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型，每只裸鼠注射非轉(zhuǎn)基LoVo細(xì)胞1×107個(gè)，21天后處死裸鼠觀察肝轉(zhuǎn)移情況，發(fā)現(xiàn)門靜脈注射法建立肝轉(zhuǎn)移模型簡(jiǎn)便，有效；再將60只裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、單純熱療組、5-FC熱療組和單純5-FC化療組，每組15只，用成功轉(zhuǎn)染質(zhì)

5、粒G1CEACDNa的LoVo細(xì)胞門靜脈注射法建立結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型，每只裸鼠注射1×107個(gè)細(xì)胞，同時(shí)對(duì)照組腹腔注射生理鹽水，單純熱療組腹腔注射43℃生理鹽水，5-FC熱療組腹腔注射43℃5-FC，單純5-FC化療組腹腔注射不加熱5-FC，注射劑量均為500mg/kg.d，連續(xù)21天，處死裸鼠觀察各組裸小鼠，5-FC熱療組結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移率和都比較少；普通病理可見對(duì)照組腫瘤組織中，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，并可見細(xì)胞核分裂相和瘤巨細(xì)胞；而單純熱

6、療組和單純5-FC化療組腫瘤組織中，瘤細(xì)胞數(shù)減少，腫瘤細(xì)胞空泡變性，細(xì)胞核皺縮，邊集甚至消失，特別是在5-FC熱療組腫瘤組織標(biāo)本中更加明顯，僅殘留少量腫瘤細(xì)胞，并可見散在的成纖維細(xì)胞，淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞；透射電鏡下可見對(duì)照組，單純熱療組和單純5-FC化療組腫瘤組織腫瘤細(xì)胞呈不規(guī)則形，體積較大，核大，核仁明顯，核分裂相易見，細(xì)胞漿內(nèi)細(xì)胞器豐富，但無明顯的凋亡小體；5-FC熱療組大量腫瘤細(xì)胞呈胞體凝縮，胞質(zhì)濃縮，核糖體及線粒體聚集，細(xì)胞

7、核固縮，核碎裂等表現(xiàn)，并可見大量有完整細(xì)胞膜包裹的凋亡小體，各組腫瘤標(biāo)本中均有CD基因的表達(dá)。 本研究得到如下結(jié)論： 1.脂質(zhì)體能成功將質(zhì)粒G1CEACDNa轉(zhuǎn)染入結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞，并且能穩(wěn)定整合持續(xù)表達(dá)。 2.熱療聯(lián)合組織特異性胞嘧啶脫氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)系統(tǒng)腹腔化療能明顯減少裸鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移瘤發(fā)生率。 3.門靜脈注射法更為有效的建立裸鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型。 4.結(jié)腸癌肝臟轉(zhuǎn)移瘤