多效生長因子Pleiotrophin對Schlafen2基因表達(dá)的影響及其調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、目的：在多效生長因子(Pleiotrophin，Ptn)基因穩(wěn)定沉默的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞Ptn-siRNA B/MEF241中，研究Pleiotrophin對Schlafen2(Slfn2)基因表達(dá)的影響，以及在此調(diào)控過程中可能涉及的細(xì)胞因子；探討Ptn沉默誘導(dǎo)Slfn2基因表達(dá)可能涉及的信號通路。 方法：前期研究發(fā)現(xiàn)，多效生長因子(Pleiotrophin，Ptn)基因穩(wěn)定沉默的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞Ptn-siRNA B/MEF

2、241中Schlafen2(Slfn2)基因高表達(dá)。在本實(shí)驗中，(1)為了驗證Ptn是否可能通過調(diào)控某種分泌型因子來抑制Slfn2表達(dá)，用Ptn穩(wěn)定沉默細(xì)胞的培養(yǎng)液培養(yǎng)對照NC細(xì)胞，通過Northern雜交法檢測培養(yǎng)不同時間后NC細(xì)胞中Slfn2表達(dá)水平變化，同時應(yīng)用RT-PCR檢測Ptn沉默細(xì)胞內(nèi)IL-1a和IL-1f6表達(dá)水平，以及外源性PTN因子(終濃度50ng/μl)對Ptn沉默細(xì)胞內(nèi)IL-1表達(dá)水平的影響；分別使用重組人白細(xì)胞

3、介素-1受體拮抗劑(rhlL-1ra)和IL-1a中和抗體阻斷IL-1的作用通路，檢測Ptn穩(wěn)定沉默細(xì)胞中Slfn2基因表達(dá)變化。 (2)為了探討Ptn沉默誘導(dǎo)Slfn2基因表達(dá)可能涉及的信號通路，應(yīng)用Western印跡檢測Ptn沉默細(xì)胞及NC細(xì)胞JNK磷酸化基礎(chǔ)水平，以及外源性PTN因子(終濃度50 ng/μl)對Ptn沉默細(xì)胞JNK磷酸化水平的影響；用SP600125和SB203580特異性阻斷JNK和p38通路，Northern印

4、跡分析Ptn沉默細(xì)胞Slfn2基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。(3)為了進(jìn)一步驗驗證Ptn沉默細(xì)胞內(nèi)表達(dá)上調(diào)的IL-1是否也對JNK通路具有調(diào)控作用，分別使用重組人白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑(rhIL-1ra)和IL-1a中和抗體阻斷IL-1的作用通路，應(yīng)用Western印跡檢測Ptn穩(wěn)定沉默細(xì)胞中JNK磷酸化水平的變化。 結(jié)果：(1)Ptn沉默細(xì)胞中Slfn2表達(dá)顯著上調(diào)，Ptn沉默細(xì)胞培養(yǎng)液可以誘導(dǎo)對照細(xì)胞Slfn2表達(dá)；Ptn沉默后細(xì)胞

5、內(nèi)IL-1a和IL-1f6表達(dá)顯著上調(diào)，外源性PTN能抑制沉默細(xì)胞中IL-1a和IL-1f6的表達(dá)； IL-1受體拮抗劑(rhIL-1ra)和IL-1a中和抗體可抑制Ptn沉默細(xì)胞中Slfn2表達(dá)。 (2)Ptn沉默誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)磷酸化JNK蛋白高表達(dá)，此誘導(dǎo)效應(yīng)可被外源性PTN抑制；阻斷JNK通路呈時間依賴性抑制Ptn沉默細(xì)胞中Slfn2基因表達(dá)；阻斷p38通路對Ptn沉默細(xì)胞中Slfn2表達(dá)水平?jīng)]有明顯影響。 (3)IL-1受體拮抗劑(