重組人CYP3A4大腸桿菌表達系統(tǒng)的建立.pdf

1、細胞色素酶P450(CYP)是含有血紅素的一族單加氧酶，主要參與代謝內源物質（如甾體、膽汁酸、脂肪酸、前列腺素、花生四烯酸、生物源性氨類等）和外源性物質的代謝。細胞色素酶能夠催化生物界各種外源物質的氧化代謝，包括藥物、植物提取成分或被真菌衍生的食物的次級代謝產(chǎn)物及大量的環(huán)境污染物、工業(yè)化合物、除草劑和除蟲劑等。代謝外源物質的人源細胞色素酶P450的形式有CYP1，CYP2和CYP3家族。這些家族中的個別細胞色素酶P450具有很廣泛的和重

2、疊的底物特異性，負責約70-80％目前臨床使用藥物的代謝。
　　 人類細胞色素酶P450在代謝內源性物質和外源性物質包括藥物中起重要的作用，因此，新的候選藥在臨床前開放階段測試其與細胞色素酶間的相互作用是標準程序。
　　 藥物和其他外源物質通過誘導或抑制對細胞色素酶活性調節(jié)，是藥物相互作用的基礎。藥物的相互作用可以引起嚴重不良反應，這將導致藥物開發(fā)的提前終止，拒絕批準上市，嚴重的處方限制，甚至于從市場上撤回藥品。最常見的

3、藥物相互作用機制是對細胞色素酶的抑制。
　　 在藥物開發(fā)前期，要常規(guī)開展實驗來確定前體物質是由哪些細胞色素酶代謝的。此外，前體物質對細胞色素酶的抑制作用可用體外培養(yǎng)的方法來評估。通常，但并非總是，一種化合物能夠抑制特定的細胞色素酶P450類型，同時也是這種細胞色素酶P450的底物。
　　 CYP3A4是人體內重要的細胞色素酶P450之一，占CYPs總量50％。CYP3A4在外源性物質代謝中具有舉足輕重的作用，據(jù)估計有高達

4、50％以上的臨床使用的藥物由CYP3A4代謝。CYP3A4能被多種藥物誘導和抑制，且具有基因多態(tài)性，這是造成藥物作用個體差異的最重要因素之一，也是發(fā)生藥物相互作用的原因之一。CYP3A4的活性部位非常強大和其作用具有彈性，能允許結構非常不同的化合物結合與隨后的代謝。
　　 大腸桿菌是用于表達人類細胞色素酶P450最常用的宿主。除了具有簡單的遺傳操作和培養(yǎng)外，大腸桿菌因其本身沒有自己的細胞色素酶，成為表達人類細胞色素酶P450的合

5、適宿主。同時，在大腸桿菌中蛋白的產(chǎn)量是非常高的，因此重組細胞色素酶P450在大腸桿菌中的表達水平是在釀酒酵母菌種表達水平的50-100倍。一般來說，人類細胞色素酶P450在大腸桿菌中表達的表達水平，可以從文獻中發(fā)現(xiàn)，在一個顯著的范圍內變化。表達水平的不同可以歸因于不同表達宿主的使用和遺傳策略的實施。在大腸桿菌中表達人類細胞色素酶P450的表達水平關鍵取決于在培養(yǎng)這些大腸桿菌菌株時的培養(yǎng)條件。
　　 1991年，哺乳動物細胞色素酶

6、P450蛋白通過對N-末端氨基酸序列的修飾第一次表達在大腸桿菌細胞中。自此后，為了使重組細胞色素酶P450在大腸桿菌中由功能的表達，各種不同的策略已經(jīng)建立，包括N-末端序列的修飾，分子伴侶的使用和在低溫度下培養(yǎng)。在所以情況下，在大腸桿菌中表達的人類細胞色素酶P450已被證明具有高效地催化氧化代表底物的能力。這些重組的細胞色素酶P450能夠應用于研究，如估計藥物的氧化反應動力學參數(shù)，也能用于鑒定人類細胞色素酶P450對藥物的代謝途徑和致癌

7、物質的消除機制。現(xiàn)在可以使用各種不同種類的重組人類細胞色素酶用于各種目的，在制備一個新的候選藥物的過程中，確定其代謝酶類已經(jīng)成為了例行常規(guī)。這種方法已被用于體外制定合理的策略來預測相關的生物利用度，毒性和藥物間相互作用。
　　 目的:
　　 比較生理鹽水和RNAlater溶液兩種處理保存組織方法對提取的總RNA的影響，以得到肝臟組織的比較好的保存方法。
　　 探討α-ALA（0.5mM和1mM）、IPTG（0.5

8、mM和1mM）、卡那霉素（50μg/mL和100μg/mL）添加濃度及菌的接種密度對重組CYP3A4膜蛋白表達水平的影響，以優(yōu)化重組CYP3A4在大腸桿菌中表達條件。
　　 用含有T7啟動子的表達載體pET-28a(+)，構建重人類CYP3A4大腸桿菌表達系統(tǒng)，以用于體外研究藥物之間的相互作用，也可以用于新藥開發(fā)時確定新藥的代謝特征及與其他藥物間的相互作用。在重組野生型CYP3A4基礎上通過定點突變獲得變異的CYP3A4，研究C

9、YP3A4各亞型的藥物代謝與野生型CYP3A4的差異來指導臨床上個體化用藥。
　　 方法:
　　 (1)人肝臟總RNA提取:收集的肝臟組織分別RNAlater溶液處理后保存-20℃下。按照TRIZOL(R)Reagent試劑說明書提取肝組織總RNA。測定總RNA的濃度和純度，并用逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)驗證總RNA的完整性。
　　 (2)CYP3A4基因的克隆、修飾及鑒定:用逆轉錄擴增法(RT-PCR

10、)，以總RNA為模板擴增目的基因CYP3A4。用1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，割膠后，用凝膠回收試劑盒回收CYP3A4cDNA。將目的基因連接到pMD(R)20-T載體上，熱激法轉化到大腸桿菌E.coliDH5α中。經(jīng)藍白斑篩選并菌落PCR驗證正確后，對目的基因進行N-末端MALLLAVF修飾和C-末端His(5)加尾修飾。連接到pMD(R)20-T（T載體）上，轉化感受態(tài)E.coliDH5α，經(jīng)藍白斑篩選，菌落PCR驗證后，送公司

11、測序驗證。測序驗證結果正確的重組T載體（含有CYP3A4基因）經(jīng)NcoI和XhoI雙酶切后連接到經(jīng)過同樣酶切的pET-28a(+)上，轉化都E.coliDH5α中，篩選、驗證并提取質粒測序。
　　 (3)根據(jù)TakaraMutanBESTKit(D401)試劑盒定點突變原理，分別設計CYP3A4突變比較高的亞型CYP3A4*3、CYP3A4*15、CYP3A4*17、CYP3A4*18和CYP3A4*19的5’端鄰接（含有突變位

12、點），3'端方向相反的引物以導入突變位點。同時根據(jù)參考文獻上的引物合成上述五種亞型的突變引物。分別用TakaraMutanBESTKit(D401)試劑盒和重疊PCR兩種方法對CYP3A4進行定點突變。突變后PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后，割膠，用膠回收試劑盒回收目的片段，分別連接到表達載體或者自連，轉化大腸桿菌后，經(jīng)克隆篩選，菌落PCR驗證后送公司測序。
　　 (4)將測序正確的重組表達載體pET-3A4轉化到表達菌株E.coliBL

13、21(DE3)中。通過SPSS13.0設計四因素二水平正交實驗，對α-ALA(0.5mM和1mM)、IPTG(0.5mM和1mM)、卡那霉素（50μg/mL和100μg/mL）添加濃度及菌的接種密度（接種1％和接種2％）進行優(yōu)化。并用SPSS13.0對結果進行分析，選擇出比較好的組合進行下一步的大規(guī)模的誘導表達。
　　 誘導結束后，將菌液置于冰上冰凍10分鐘，離心收集菌體。用TES（Tris-EDTA-sucrose）重懸菌體，

14、并加入含溶菌酶的Tris緩沖液，冰上搖床孵育裂解細胞。離心后，收集球狀體.沉淀用SRB緩沖液(spheroplasts-resuspendedbuffer)再懸浮，并在-80℃保存。保存的球狀體在室溫下解凍，然后加入1mMPMSF（phenylmethanesulfonylfluoride）和蛋白酶抑制劑。對懸浮液進行超聲處理破碎處理后，離心，取上清液小心的轉移到EP管中，再次高倍離心收集膜片段，膜片段用PB重懸，-80℃保存，備用。用

15、BCA蛋白濃度定量分析測定膜蛋白的濃度。BSA蛋白濃度和OD578做回歸分析。提取的膜蛋白經(jīng)Westernblot驗證是否是所需的目的蛋白。
　　 結果:
　　 (1)總RNA的濃度在300μg/gFW以上，純度在OD260/OD280為1.96±0.015(純凈的RNA的OD260/OD280值為2.0)，經(jīng)逆轉錄聚合酶鏈式反應驗證發(fā)現(xiàn)總RNA的完整性比較，可以用于后續(xù)實驗。
　　 (2)目的基因連接到T載體上

16、經(jīng)克隆篩選后，測序驗證為CYP3A4基因。N-末端和C-末端修飾后，經(jīng)測序驗證修飾成功。連接到表載體上，克隆篩選后，測序驗證為CYP3A4基因。
　　 (3)對CYP3A4進行定點突變后，獲得CYP3A4*3，*15，*17，*18，*19亞型，經(jīng)PCR驗證正確，當測序結果顯示僅有CYP3A4*19突變成功。
　　 (4)BSA蛋白濃度和OD578做回歸分析，最終確定線性回歸作為標準曲線(R2=0.999，P＜0.001

17、)。用BCA蛋白濃度定量分析試劑盒測定的膜蛋白濃度在65μg/mL左右，α-ALA、抗生素（卡那霉素）、T7啟動子誘導劑IPTG及接種密度高低兩水平中對膜蛋白的表達水平的影響沒有統(tǒng)計學意義(P值分別是0.973，0.270，0.346，0.194)。誘導表達后的膜蛋白經(jīng)Westernblot驗證為重組CYP3A4蛋白。
　　 結論:
　　 成功完成了對CYP3A4的表達載體構建，并獲得了CYP3A4的一個亞型CYP3A4