燃煤污染型氟中毒大鼠腦組織膽堿能系統(tǒng)及NOS-NO改變?cè)谀X損傷機(jī)制中的作用.pdf

1、地方性氟中毒（簡(jiǎn)稱地氟?。┦堑湫偷牡厍蚧瘜W(xué)性疾病，累及世界許多國(guó)家和地區(qū)，我國(guó)是受害較重的國(guó)家之一。地氟病主要分為飲水型、燃煤污染型和飲茶型三種。貴州省是燃煤污染型氟中毒最為嚴(yán)重的地區(qū)，尤其以畢節(jié)地區(qū)為重災(zāi)區(qū)，造成燃煤污染型氟中毒的主要因素是當(dāng)?shù)鼐用袷秤煤扛叩娜济汉婵具^(guò)的玉米、辣椒等食物所致。過(guò)量的氟可通過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦組織，在腦組織內(nèi)蓄積，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生損害作用。慢性氟中毒對(duì)腦損傷的影響已成為當(dāng)前國(guó)際氟研究中較為熱門的研究問(wèn)題。有

2、關(guān)燃煤污染型氟中毒引起腦損傷的實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道較少。
　　慢性氟中毒腦損傷的機(jī)制仍不十分清楚，目前認(rèn)為與過(guò)量氟引起的氧化應(yīng)激水平升高和膽堿能系統(tǒng)改變等有關(guān)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膽堿能系統(tǒng)與認(rèn)知、學(xué)習(xí)記憶功能、對(duì)大腦其它神經(jīng)遞質(zhì)釋放的調(diào)節(jié)等有關(guān)。氟中毒對(duì)腦內(nèi)膽堿能系統(tǒng)的影響已引起學(xué)者們的關(guān)注。最近幾年，一氧化氮(nitric oxide，NO)作為自由基在氟中毒引起的氧化應(yīng)激研究方面開始引起人們的重視。
　　為了深入研究氟的神經(jīng)損傷機(jī)制

3、，特別是探討燃煤污染型氟中毒腦損傷的分子發(fā)生機(jī)制，我們復(fù)制了燃煤污染型氟中毒大鼠及其子代模型來(lái)觀察氟中毒大鼠腦組織的病理學(xué)變化和對(duì)仔鼠腦發(fā)育的影響;研究燃煤污染型氟中毒大鼠及其子代空間學(xué)習(xí)記憶能力改變;研究燃煤污染型氟中毒大鼠及其子代腦組織膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的改變，包括尼古丁受體(Nicotinic acetylcholine receptors， nAChRs)α3、α4、α7亞單位在蛋白和mRNA表達(dá)水平改變，膽堿酯酶(Cholines

4、terase，ChE)活性改變;研究燃煤污染型氟中毒大鼠及其子代腦組織NOS在蛋白和mRNA表達(dá)水平改變和NO含量改變，并分析nAChRs、NOS蛋白表達(dá)水平、NO含量與大鼠認(rèn)知能力的相關(guān)關(guān)系，探討腦組織膽堿能系統(tǒng)和NOS/NO改變?cè)谌济何廴拘头卸灸X損傷機(jī)制中的作用。
　　方法:燃煤污染型氟中毒大鼠模型復(fù)制:SD大鼠48只，按染氟劑量分為對(duì)照組(Control)、低氟組(Lower Fluoride，LF)、高氟組(Hight

5、Fluoride，HF)三組，每組各8只大鼠，雌雄各半。對(duì)照組喂飼常規(guī)飼料，低氟組、高氟組大鼠以燃煤污染型地方病氟中毒重病區(qū)燃煤烘烤的當(dāng)?shù)赜衩诪橹饕暳?，配制不同含氟量飼料喂養(yǎng)大鼠，復(fù)制燃煤污染型氟中毒動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)期分別為3個(gè)月和6個(gè)月。燃煤污染型氟中毒子代模型復(fù)制:SD大鼠32只，隨機(jī)分為2組（每組16只，雌性12只，雄性4只），即高氟組和對(duì)照組，飼養(yǎng)6個(gè)月后雌雄合籠，取其所生一月齡仔鼠作為研究對(duì)象，各10只仔鼠。動(dòng)物在交配前、交配

6、、懷孕和哺乳期間喂飼方法與相同組別的成年大鼠一致。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，用Morris水迷宮檢測(cè)成年大鼠及子代大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的變化;用蘇木素-伊紅(Hematoxylin-eosin，HE)、尼氏染色(Nissl)及電子顯微鏡顯示神經(jīng)細(xì)胞的病理變化;用硝酸還原酶法測(cè)定腦組織NO含量，比色法測(cè)定腦組織ChE活性;用蛋白印跡方法測(cè)定腦組織nAChRα3、α4、α7及nNOS蛋白表達(dá)水平，用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-

7、time quantitativereverse transcription-polymerase chain reaction)測(cè)定腦組織nAChRα3、α4、α7及nNOS的mRNA水平。
　　成年大鼠研究結(jié)果:與對(duì)照組比較，氟負(fù)荷指標(biāo):染氟3、6個(gè)月之低氟組、高氟組大鼠尿氟、骨氟、腦組織氟含量均顯著性增加，并隨染氟時(shí)間延長(zhǎng)和染氟劑量增加氟含量增加更明顯。生長(zhǎng)發(fā)育:染氟3個(gè)月及染氟6個(gè)月大鼠體質(zhì)量有降低趨勢(shì)。形態(tài)學(xué)改變:染氟3

8、、6個(gè)月之低氟組、高氟組大鼠神經(jīng)細(xì)胞平均灰度值均顯著性增加，尼氏小體顯著性下降。超微結(jié)構(gòu):染氟6個(gè)月低氟組與高氟組大鼠神經(jīng)細(xì)胞核膜局部缺如、線粒體部分嵴和膜融合、消失;突觸前膜內(nèi)線粒體部分嵴和膜融合、模糊不清、突觸間隙局部融合，以高氟組大鼠神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)病變更嚴(yán)重。行為學(xué)改變:染氟3個(gè)月高氟組大鼠學(xué)習(xí)能力顯著性下降，記憶能力無(wú)顯著性改變;染氟6個(gè)月，低氟組與高氟組大鼠學(xué)習(xí)能力與空間記憶能力均顯著性下降，過(guò)量氟對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響，早期

9、主要以高濃度氟影響學(xué)習(xí)能力，隨染氟時(shí)間延長(zhǎng)，低濃度氟亦可學(xué)習(xí)能力，而且高濃度氟不僅影響大鼠學(xué)習(xí)能力，空間記憶能力亦受影響。膽堿能系統(tǒng)改變:染氟3、6個(gè)月之低氟組和高氟組大鼠nAChRα3、α4、α7蛋白表達(dá)水平、mRNA水平、ChE活性均顯著性下降（P＜0.05或＜0.01），提示氟可在早期、低劑量時(shí)使大鼠nAChRs在蛋白與mRAN水平發(fā)生改變。nNOS改變:染氟3、6個(gè)月之低氟組和高氟組大鼠腦組織nNOS蛋白表達(dá)均顯著性增加（P＜0

10、.05或＜0.01），mRNA水平均顯著性下降（P＜0.05），過(guò)量氟對(duì)nNOS蛋白與mRNA水平的影響在染氟早期及低濃度氟時(shí)即已發(fā)生。NO含量改變:染氟3個(gè)月高氟組大鼠腦組織NO含量顯著性下降（P＜0.05），染氟6個(gè)之低氟組和高氟組大鼠腦組織NO含量顯著性升高（P＜0.05或＜0.01），過(guò)量氟可引起大鼠腦組織NO含量改變。相關(guān)性分析顯示過(guò)量氟引起大鼠學(xué)習(xí)記憶能力降低與腦組織nAChRs蛋白表達(dá)下降及nNOS蛋白表達(dá)增加、NO含量增

11、加有關(guān)，其間有量效關(guān)系。
　　高氟組子代大鼠研究結(jié)果:與對(duì)照組仔鼠比較，尿氟、骨氟、腦組織氟含量均顯著性增加;體質(zhì)量、腦組織重量及腦器官系數(shù)均顯著性降低;神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞核核膜局部有缺如，染色質(zhì)邊集;突觸間隙融合;突觸前膜內(nèi)線粒體模糊不清，突觸結(jié)構(gòu)模糊不清;學(xué)習(xí)與記憶能力均顯著性降低;nAChRα3、α4其蛋白和mRNA基因水平均顯著性降低，nAChRα7亞單位蛋白水平顯著性下降，mRNA基因水平顯著性升高;ChE活性均顯著性下降;n

12、NOS蛋白表達(dá)水平和mRNA基因表達(dá)水平均顯著性增高;NO含量顯著性增加。相關(guān)性分析顯示過(guò)量氟引起子代學(xué)習(xí)記憶能力降低與腦組織nAChRs蛋白表達(dá)下降及nNOS蛋白表達(dá)增加、NO含量增加有關(guān)，其間有量效關(guān)系。
　　綜上所述，燃煤污染型氟中毒在早期及低濃度時(shí)即可引起大鼠腦組織nAChRα3、α4和α7蛋白水平降低，mMRA基因水平變化;以及與神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)的ChE活性下降;引起腦組織nNOS蛋白水平增加，mMRA基因水平改變，NO含量

13、改變;早期低濃度燃煤氟主要影響大鼠學(xué)習(xí)能力，晚期高濃度燃煤氟不僅影響大鼠學(xué)習(xí)能力亦可影響空間記憶能力?？赡苁沁^(guò)量氟刺激nNOS表達(dá)持續(xù)性增加，NO含量改變，導(dǎo)致自由基含量增加或清除不足，損傷神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，影響nAChRs蛋白及mRNA表達(dá)水平，從而降低大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。燃煤污染型氟中毒仔鼠神經(jīng)發(fā)育改變、學(xué)習(xí)記憶能力降低，亦可能是由于過(guò)量氟引起nNOS表達(dá)增加，導(dǎo)致NO含量增加，從而造成神經(jīng)細(xì)胞受損和nAChRs功能降低所致。相關(guān)性分