LPS經(jīng)鼻小鼠帕金森病模型的建立及Rho激酶靶點(diǎn)干預(yù)探討.pdf

1、第一部分LPS經(jīng)鼻小鼠PD模型的建立
　　目的:以MPTP經(jīng)鼻為陽性對照，生理鹽水為陰性對照，研究LPS經(jīng)鼻小鼠行為學(xué)、病理學(xué)和神經(jīng)生物化學(xué)等PD特征性的改變。
　　方法:10月齡雌性C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為生理鹽水對照組、LPS組和MPTP組，采用LPS10μg/只、MPTP400μg/只隔天右側(cè)經(jīng)鼻滴注5個(gè)月，期間第1、3、5個(gè)月分別使用曠場實(shí)驗(yàn)觀察小鼠的運(yùn)動功能，5個(gè)月時(shí)膠布移除實(shí)驗(yàn)觀察小鼠左右側(cè)肢體運(yùn)動功能的對稱

2、性。5個(gè)月后，取腦進(jìn)行免疫熒光染色、同時(shí)提取組織蛋白，采用Western blot法檢測黑質(zhì)內(nèi)TH（酪氨酸羥化酶）、α-synuclein(α-突觸核蛋白)以及腦組織內(nèi)CHAT（乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶）的表達(dá)。HPLC檢測小鼠紋狀體內(nèi)多巴胺(DA)以及其代謝產(chǎn)物DOPAC、高相草酸(HVA)、DA/HVA以及其他遞質(zhì)包括去甲腎上腺素(NE)、異丙腎上腺素(Iso)、5-羥色胺(5-HT)及5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)的變化。
　　結(jié)果:

3、LPS單側(cè)經(jīng)鼻可引起小鼠運(yùn)動不對稱及運(yùn)動功能減退，MPTP單側(cè)經(jīng)鼻并未引起小鼠運(yùn)動障礙;LPS或MPTP經(jīng)鼻均可引起小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元丟失及α-synuclein的沉積;LPS或MPTP經(jīng)鼻可引起小鼠紋狀體內(nèi)TH表達(dá)減少及DA等神經(jīng)遞質(zhì)釋放減少。
　　結(jié)論:LPS經(jīng)鼻可以制備小鼠PD模型，呈現(xiàn)PD模型的典型特征。
　　第二部分LPS經(jīng)鼻小鼠PD模型的機(jī)制探討
　　目的:體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)探討LPS致小鼠PD的機(jī)制。

4、r>　　方法:LPS經(jīng)鼻制備的PD小鼠體外培養(yǎng)脾臟單核細(xì)胞（T細(xì)胞），加入外源性α-synuclein（1μg/mL），48小時(shí)后觀察系統(tǒng)免疫炎癥反應(yīng)。取PD小鼠腦組織進(jìn)行黑質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞和磷酸化NF-κB的免疫熒光染色，同時(shí)提取組織蛋白，采用Western blot法檢測小鼠腦內(nèi)NF-κB的表達(dá)，ELISA法檢測黑質(zhì)內(nèi)炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌。Western blot法檢測小鼠腦內(nèi)M1型小膠質(zhì)細(xì)胞和M2型小膠質(zhì)細(xì)

5、胞標(biāo)志物iNOS與Arginase-1（Arg-1）的表達(dá)。體外使用LPS(1μg/mL)刺激小膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系BV-2細(xì)胞，48小時(shí)后收集上清液孵育PC12多巴胺能神經(jīng)元，檢測BV-2細(xì)胞內(nèi)iNOS、核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB和AP-1的表達(dá)及Rho激酶底物MYPT和MLC，上清液（條件培養(yǎng)液）IL-1β、IL-6、TNF-α、NO等炎癥因子和炎癥介質(zhì)的釋放，PC12神經(jīng)元細(xì)胞活力及LDH釋放。
　　結(jié)果:LPS經(jīng)鼻制備的PD小鼠體外

6、培養(yǎng)脾臟細(xì)胞的免疫炎癥反應(yīng)包括抗原特異性T細(xì)胞，NO和炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和Th1，Th2和Th17因子與對照組相比均沒有差別。小鼠腦內(nèi)NF-κB明顯激活，黑質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞密度增加，磷酸化NF-κB表達(dá)增加，釋放的炎癥因子IL-β、TNF-α也明顯增加。此外，還發(fā)現(xiàn)LPS經(jīng)鼻小鼠腦內(nèi)M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Arg-1的表達(dá)明顯下降，M1型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物iNOS與Arg-1的比值明顯升高。體外實(shí)驗(yàn)表明LPS可以激活

7、小膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系BV-2細(xì)胞，促進(jìn)其細(xì)胞內(nèi)iNOS的表達(dá)升高，核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB和AP-1的表達(dá)增加，其上清液（條件培養(yǎng)液）中IL-1β、IL-6、TNF-α、NO等炎癥因子和炎癥介質(zhì)的釋放明顯增加;LPS可磷酸化BV-2細(xì)胞內(nèi)的Rho激酶底物MYPT和MLC; LPS刺激BV-2細(xì)胞的條件培養(yǎng)液可引起PC12神經(jīng)元細(xì)胞活力下降和LDH釋放增加。
　　結(jié)論:LPS經(jīng)鼻未能引起小鼠系統(tǒng)免疫炎癥反應(yīng)，僅誘導(dǎo)腦內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞向M1型

8、轉(zhuǎn)化，誘發(fā)腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)。LPS體外可激活BV-2細(xì)胞引起炎件反應(yīng)，激活Rho激酶，其條件培養(yǎng)液可引起PC12神經(jīng)元細(xì)胞活力下降和死亡。
　　第三部分Rho激酶抑制劑法舒地爾對LPS經(jīng)鼻小鼠PD模型的保護(hù)作用及機(jī)制探討
　　目的:了解Rho激酶抑制劑法舒地爾(Fasudil)在LPS經(jīng)鼻制備的PD小鼠中的治療潛能及可能機(jī)制。
　　方法:8-10周齡雌性C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為生理鹽水對照組、LPS組、法舒地爾組，采

9、用LPS10μg/只隔天右側(cè)經(jīng)鼻滴注1個(gè)月，同時(shí)法舒地爾組給予（40mg/kg）腹腔注射，1個(gè)月時(shí)使用曠場實(shí)驗(yàn)觀察小鼠的運(yùn)動功能，膠布移除實(shí)驗(yàn)觀察小鼠左右側(cè)肢體運(yùn)動功能的對稱性。1個(gè)月后取腦Western blot法檢測Rho激酶底物MYPT和MLC的變化。免疫熒光染色、Western blot法檢測黑質(zhì)和嗅球內(nèi)TH、α-synuclein以及紋狀體內(nèi)TH的表達(dá)。Western blot法進(jìn)一步檢測PD小鼠腦組織內(nèi)NF-κB的表達(dá)及M1

10、型小膠質(zhì)細(xì)胞和M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物iNOS、Arginase-1（Arg-1）的表達(dá)以及兩者比值的變化。
　　結(jié)果:LPS經(jīng)鼻可磷酸化腦內(nèi)的Rho激酶底物MYPT和MLC，而法舒地爾可明顯抑制磷酸化MYPT和MLC的表達(dá)。法舒地爾干預(yù)可改善LPS經(jīng)鼻引起的小鼠運(yùn)動功能減退和運(yùn)動不對稱、小鼠黑質(zhì)和嗅球多巴胺能神經(jīng)元丟失、α-synuclein沉積、腦內(nèi)炎癥反應(yīng)并誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化等改變。
　　結(jié)論:法舒地爾可有效抑制

11、LPS經(jīng)鼻激活的腦內(nèi)Rho激酶，通過誘導(dǎo)腦內(nèi)M1型小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化，抑制腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)緩解LPS經(jīng)鼻引起的小鼠PD行為學(xué)和病理學(xué)的改變。
　　結(jié)論:
　　1.LPS經(jīng)鼻可致小鼠運(yùn)動減少、黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的丟失、α-synuclein的沉積、紋狀體內(nèi)TH表達(dá)減少及神經(jīng)遞質(zhì)的釋放減少等行為學(xué)、病理學(xué)和神經(jīng)生物化學(xué)的改變，從而成功建立小鼠PD模型。
　　2.LPS致小鼠PD的機(jī)制可能是通過誘導(dǎo)腦內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞向M1型