淡豆豉異黃酮抗動(dòng)脈粥樣硬化分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：淡豆豉（SSP）是大豆成熟種子經(jīng)發(fā)酵制成的藥食兼用的傳統(tǒng)藥物，多年來(lái)臨床僅用其解表除煩的功效?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，淡豆豉中異黃酮類(lèi)（Isoflavone）是它的主要活性成分，是淡豆豉發(fā)揮藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。前期研究發(fā)現(xiàn)淡豆豉具有降低血糖，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、保護(hù)主動(dòng)脈內(nèi)膜、抑制平滑肌細(xì)胞增殖等生物活性，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化（AS）有明顯的保護(hù)作用。為闡明淡豆豉抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制、擴(kuò)大淡豆豉的臨床應(yīng)用及研制抗動(dòng)脈粥樣硬化新藥，本研究采用原代培養(yǎng)

2、的大鼠血管平滑肌細(xì)胞（VSMC），從細(xì)胞以及分子等不同水平，系統(tǒng)探討了淡豆豉防治AS的作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.淡豆豉異黃酮對(duì)血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響
　　 1.1大鼠主動(dòng)脈VSMC原代培養(yǎng)與鑒定
　　 采用組織貼塊法培養(yǎng)原代大鼠VSMC；α-actin細(xì)胞免疫組織化學(xué)技術(shù)鑒定VSMC，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及SM-actin染色陽(yáng)性率。
　　 1.

3、2淡豆豉異黃酮對(duì)體外培養(yǎng)VSMC的細(xì)胞毒性檢測(cè)
　　 藥物濃度梯度設(shè)定為1、10、100、500、1000、5000、10000、50000μg/L，作用時(shí)間為24h；MTT法測(cè)定各孔的存活率，以O(shè)D值表示。
　　 1.3淡豆豉異黃酮對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC增殖的干預(yù)作用
　　 淡豆豉異黃酮干預(yù)濃度為如下梯度：10、50、100、200、500μg/L，預(yù)孵育時(shí)間1、4、12、24h；AngⅡ終濃度為10-7mo

4、l/L，與藥物共培養(yǎng)24h；MTT法進(jìn)行測(cè)定，確定藥物抑制增殖的最佳作用濃度與作用時(shí)間。
　　 1.4 VSMC細(xì)胞周期檢測(cè)
　　 實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、AngⅡ模型組、淡豆豉異黃酮（50、100、200μg/L）+AngⅡ組、大豆異黃酮（ISO）（200μg/L）+AngⅡ組。淡豆豉異黃酮、大豆異黃酮預(yù)孵育時(shí)間均為24h；AngⅡ終濃度為10-7mol/L，與藥物共孵育24h；收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。
　

5、　 2.淡豆豉異黃酮對(duì)增殖血管平滑肌細(xì)胞JAK2/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響
　　 2.1 AG490、淡豆豉異黃酮、大豆異黃酮對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC增殖的干預(yù)作用
　　 實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、AngⅡ模型組、AG490（50μmol/L）+AngⅡ組、淡豆豉異黃酮（50、100、200μg/L）+AngⅡ組、大豆異黃酮（200μg/L）+AngⅡ組。AG490于AngⅡ干預(yù)前16h進(jìn)行孵育，淡豆豉異黃酮、大豆異黃酮

6、于AngⅡ干預(yù)前24h進(jìn)行孵育。MTT法進(jìn)行測(cè)定。
　　 2.2 AngⅡ受體（AT1R）mRNA表達(dá)水平檢測(cè)
　　 分組及藥物（AG490、淡豆豉異黃酮、大豆異黃酮）干預(yù)同2.1，AngⅡ刺激30min。Trizol法提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR法測(cè)定VSMC細(xì)胞膜上AT1R的表達(dá)。
　　 2.3 JAK2/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)
　　 分組及藥物（AG490、淡豆豉異黃酮、大豆異黃酮

7、）干預(yù)同2.1，AngⅡ刺激2h。SDS裂解液提取細(xì)胞總蛋白，Western Blot檢測(cè)Janus激酶2（JAK2）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3（STAT3）蛋白及其磷酸化蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.淡豆豉異黃酮對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響
　　 1.1大鼠VSMC鑒定
　　 VSMC培養(yǎng)72h后即有細(xì)胞從組織周?chē)纬觯煞派錉钆帕?，?xì)胞呈長(zhǎng)梭形、三角形或不規(guī)則形，胞漿豐富，核卵

8、圓居中，有多個(gè)核仁，隨著爬出細(xì)胞的增多表現(xiàn)出VSMC特征的“峰谷”狀生長(zhǎng)。α-actin抗體標(biāo)記后，胞漿中可見(jiàn)大量棕黃色與細(xì)胞長(zhǎng)軸平行的纖維細(xì)絲，大于97％的細(xì)胞SM-actin染色陽(yáng)性。
　　 1.2淡豆豉異黃酮的細(xì)胞毒作用
　　 藥物濃度達(dá)到10μg/mL時(shí)，OD值較正常對(duì)照組顯著降低，多數(shù)細(xì)胞皺縮成球形、少數(shù)死亡細(xì)胞漂浮在孔中。提示藥物濃度大于10μg/mL時(shí)，出現(xiàn)明顯細(xì)胞毒作用。
　　 1.3淡豆豉異黃酮

9、對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC增殖的影響
　　 10-7mol/L AngⅡ可明顯促進(jìn)VSMC增殖。淡豆豉異黃酮預(yù)孵育細(xì)胞，對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的增殖產(chǎn)生了不同程度的抑制作用：與AngⅡ組比較，50μg/L預(yù)孵育12、24h；100μg/L預(yù)孵育1、4、12、24h；200μg/L預(yù)孵育1、4、24h；500μg/L預(yù)孵育4h可使OD值顯著降低；10μg/L預(yù)孵育1、4、12、24h；50μg/L預(yù)孵育1、4h；200μg/L預(yù)孵育12h；

10、500μg/L預(yù)孵育1、12、24h OD值有下降趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析可知：淡豆豉異黃酮抑制VSMC增殖的最佳作用濃度為50、100、200μg/L；最佳預(yù)孵育時(shí)間為24h。
　　 1.4淡豆豉異黃酮對(duì)大鼠VSMC細(xì)胞周期的影響
　　 與正常對(duì)照組比較，AngⅡ組G0/G1期細(xì)胞比例明顯下降，S期細(xì)胞比例明顯增加；與AngⅡ組比較，各用藥組G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加，S期細(xì)胞比例明顯下降。
　　 2.淡豆

11、豉異黃酮對(duì)增殖血管平滑肌細(xì)胞JAK2/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響
　　 2.1 AG490、淡豆豉異黃酮、大豆異黃酮對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC增殖的影響
　　 AngⅡ組OD值較正常對(duì)照組明顯升高；與AngⅡ組比較，AG490組、淡豆豉異黃酮100μg/L、200μg/L組、大豆異黃酮組OD值顯著降低，淡豆豉異黃酮50μg/L組OD值有下降趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.2對(duì)VSMC AT1R mRNA表達(dá)的影

12、響
　　 AngⅡ組AT1R表達(dá)較正常組明顯升高；與AngⅡ組比較，AG490組、淡豆豉異黃酮200μg/L組AT1R表達(dá)明顯降低，淡豆豉異黃酮100/μg/L組、大豆異黃酮組也使AT1R表達(dá)明顯下降，淡豆豉異黃酮50μg/L組AT1R表達(dá)水平下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.3對(duì)VSMC JAK2/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白表達(dá)的影響
　　 各實(shí)驗(yàn)組JAK2、STAT3蛋白總量無(wú)顯著差異。AngⅡ組磷酸化JAK

13、2（p-JAK2）、磷酸化STAT3（p-STAT3）蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組明顯升高；與AngⅡ組比較，AG490組、淡豆豉異黃酮200μg/L組、大豆異黃酮組p-JAK2、p-STAT3表達(dá)明顯下降；淡豆豉異黃酮50μg/L組使p-STAT3表達(dá)顯著下降，p-JAK2蛋白表達(dá)水平有下降趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；淡豆豉異黃酮100μg/L組可下調(diào)p-JAK2、p-STAT3表達(dá)量，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：淡豆豉異黃酮（10～50