P-選擇素不同功能域克隆、單抗制備及其功能的初步研究.pdf

1、P-選擇素（P-selectin）是細胞粘附分子選擇素家族的主要成分,是急性炎癥早期介導炎癥細胞向受損部位趨集過程中的重要因素.進一步闡明P-selectin結(jié)構(gòu)與功能及其在腎臟疾病等病理機制中的作用,并為針對其的臨床特異性抗粘附治療奠定基礎(chǔ).為此我們設(shè)計并進行了以下的研究.利用PT-PCR技術(shù),該研究首先從人外周血血小板中克隆出P-selectincDNA,并擴增和獲得了其中Lectin片段及Lectin-EGF片段,然后將目的基因分

2、別插入含有Kan的質(zhì)粒pET42b（+）中和含有Amp的質(zhì)粒pcDNA4/HisMaxA中.再將含有目的基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入DH5α中進行大量擴增并鑒定.經(jīng)測序發(fā)現(xiàn),所獲目的基因序列與相關(guān)文獻和GeneBank（登錄號M25322）序列完全一致.將含有目的基因的重組質(zhì)粒分別在真核表達系統(tǒng)CHO和原核表達系統(tǒng)BL21中進行表達,利用限制性酶切、測序以及蛋白印跡檢測發(fā)現(xiàn)目的基因均能表達.但在真核表達系統(tǒng)中的表達水平偏低.選擇了原核表達系統(tǒng)B

3、L21.將一定量表達的目的蛋白通過Ni-NTA柱進行純化,得到mg級純化的蛋白,通過SDS-PAGE電泳、ELISA、WesternBlot方法證明所獲蛋白即為目的蛋白.利用雜交瘤技術(shù)先行制備了抗人P-selectinLectin-EGF單克隆抗體.并通過ELISA方法,證實所獲單克隆抗體能與P-selectin抗原、及其Lectin、Lectin-EGF片段特異性反應;通過間接細胞免疫熒光染色和流式細胞儀檢測.兩個試驗均證實了該研究所