核移植制備t-PAm山羊乳腺生物反應(yīng)器的初步研究.pdf

1、人組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)是一種理想的溶血栓藥物,能高效特異溶解因栓而不引起全身出血現(xiàn)象,早期應(yīng)用t-PA的溶解血栓是治療急性心肌梗塞的最佳方案.目前市場(chǎng)上銷(xiāo)售的t-PA主要是以傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝(哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法)生產(chǎn)的,成本高昂,導(dǎo)致價(jià)格昂貴.乳腺生物反應(yīng)器是生產(chǎn)基因藥物一種很好的方法.我們采用劉士輝等構(gòu)建的t-PAmcDNA構(gòu)建了乳腺特異表達(dá)載體pGBCt-PAm.以山羊β—酪蛋白長(zhǎng)4.1k啟動(dòng)了調(diào)控t-PAm的表達(dá),并包

2、含了β—酪蛋白部分內(nèi)含子和外顯子序列,在啟動(dòng)子前面加入204k的雞β-珠蛋白絕緣子序列,以消除或減輕"位點(diǎn)"效應(yīng).構(gòu)建的t-PA突變體(t-PAm)乳腺特異表達(dá)載體pGBCt-PAm在母兔乳腺進(jìn)行了瞬間表達(dá)的實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證了載體的有效性.將pGBCt-PAm去除原核序列后回收線(xiàn)性片段,采用電擊和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染兩種方式轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細(xì)胞(gFFC),經(jīng)G418篩選培養(yǎng)基篩選及PCR檢測(cè),最終得到了7株能有效擴(kuò)增的PCR檢測(cè)陽(yáng)性的細(xì)胞克隆.陽(yáng)性