銀耳生物反應(yīng)器的基礎(chǔ)研究.pdf

1、本研究以銀耳芽孢為材料，進(jìn)行如下研究：采用分子標(biāo)記篩選確定用作轉(zhuǎn)化的銀耳受體菌株；優(yōu)化電激轉(zhuǎn)化條件：構(gòu)建蘑菇gpd啟動子調(diào)控的egfp基因銀耳表達(dá)載體，驗(yàn)證egfp基因在銀耳中的表達(dá)：克隆銀耳自身的gpd啟動子，利用egfd基因驗(yàn)證銀耳的啟動子活性：構(gòu)建銀耳gpd啟動子調(diào)控人胰島素基因銀耳表達(dá)載體轉(zhuǎn)化銀耳。具體結(jié)果如下： 1.銀耳受體菌株的篩選。 菌株篩選結(jié)果表明，采用ISSR和RAPD兩種分子標(biāo)記，三個(gè)引物將14個(gè)菌株

2、分為五類，其中第V類包含的9個(gè)菌株在DNA水平上沒有任何差異，說明銀耳菌種同種異名現(xiàn)象比較嚴(yán)重。根據(jù)樹狀分析圖挑選出有一定差異的5個(gè)菌株，衡量生長速度，測定各菌株芽孢產(chǎn)量，結(jié)果表明T0006產(chǎn)量最高，生長速度最快，T0001和T0026次之。但經(jīng)抗藥性測定，T0006對卡那霉素和潮霉素有抗性，T0001對潮霉素敏感性較強(qiáng)，因此根據(jù)以上初步篩選的結(jié)果最后確定T0001作為轉(zhuǎn)化受體菌株，潮霉素為篩選標(biāo)記。 2.高效電激轉(zhuǎn)化體系的建立

3、。 以T0001作為轉(zhuǎn)化受體菌株，影響菌株T0001的電激轉(zhuǎn)化條件的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株T0001的電激轉(zhuǎn)化需要先對芽孢進(jìn)行預(yù)處理才能獲得轉(zhuǎn)化子，用2％溶壁酶處理1h效果最佳。電壓300伏，電阻600歐姆，電容25微法為菌株T0001的最適轉(zhuǎn)化條件。此外，在電激緩沖液中加入濃度為7％ PEG4000時(shí)，轉(zhuǎn)化率得到較大提高，達(dá)到9.25×106個(gè)/μg質(zhì)粒DNA。 3.蘑菇gpd啟動子調(diào)控egfp基因銀耳表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)

4、初探。 以質(zhì)粒pCAMBIA1300和pEGFP為出發(fā)質(zhì)粒，構(gòu)建了帶有雙孢蘑菇gpd啟動子、Tnos終止子及egfp基因的片段的表達(dá)載體pCB-BEGFP，采用以上優(yōu)化后的電激條件利用電激介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，把攜帶egfp基因的銀耳表達(dá)載體pCB-BEGFP導(dǎo)入菌株T0001中，驗(yàn)證egfp基因在菌株T0001中的表達(dá)情況。轉(zhuǎn)化獲得了大量的轉(zhuǎn)化子，通過對轉(zhuǎn)化子的PCR檢測(包括egfp基因、Tnos終止子)，證實(shí)了egfp基因已整合到轉(zhuǎn)

5、化子基因組DNA中。轉(zhuǎn)化子用藍(lán)光激發(fā)，在熒光顯微鏡下發(fā)綠光及其蛋白電泳表明，雙孢蘑菇gpd啟動子在銀耳芽孢中可以很好的調(diào)控外源基因的表達(dá)，egfp基因在銀耳中得到表達(dá)。 4.銀耳3-磷酸甘油醛脫氫酶(gpd)基因及其啟動子的克隆及功能初步分析。 采用根據(jù)gpd氨基酸序列設(shè)計(jì)的簡并引物，以菌株T0001總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄PCR克隆了3-磷酸甘油醛脫氫酶基因的cDNA，該序列長1008bp，編碼的蛋白含有336個(gè)氨基酸殘

6、基，與9種真菌3-磷酸甘油醛脫氫酶氨基酸序列進(jìn)行比對，相似性達(dá)81.52％。通過Tail-PCR方法克隆了該基因的長度500 bp的啟動子區(qū)域，序列分析表明片段含有TATAAA盒，位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)“A”上游25位置，還含有其它很多有關(guān)啟動子的元件和因子。構(gòu)建了含有此啟動子區(qū)域及gus基因的銀耳表達(dá)載體TGP1301，電激轉(zhuǎn)化菌株T0001，隨機(jī)挑取的5個(gè)轉(zhuǎn)化子，GUS活性檢測，有4個(gè)變?yōu)闇\藍(lán)色，初步證明該啟動子有驅(qū)動外源基因在菌株T00

7、01芽孢中表達(dá)的能力。 5.利用勸基因研究銀耳的啟動子活性。 利用egfp基因研究銀耳的啟動子活性結(jié)果表明：成功構(gòu)建了含有銀耳gpd啟動子及egfp基因的銀耳表達(dá)載體pCB-TEGFP，根據(jù)以上電激轉(zhuǎn)化條件轉(zhuǎn)化銀耳芽孢，載體pCB-TEGFP被轉(zhuǎn)入菌株T0001基因組中；轉(zhuǎn)化子藍(lán)光的激發(fā)下，熒光顯微鏡觀察到很強(qiáng)的綠光；熒光光譜測定兩個(gè)轉(zhuǎn)化子最大熒光激發(fā)波長Ex分別為492衄和484nm，最大熒光發(fā)射波長Em都為510 n

8、m；轉(zhuǎn)化子蛋白SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)化子的蛋白與陰性對照相比，在大約27 kDa與預(yù)期的蛋白分子量相近處有一明顯的蛋白條帶出現(xiàn)。這些結(jié)果表明egfp基因在銀耳芽孢中正確表達(dá)，克隆的銀耳gpd啟動子具有很好的調(diào)控外源基因在銀耳中表達(dá)的能力。 6.人胰島素基因轉(zhuǎn)化銀耳及分子檢測。 將銀耳gpd啟動子試用于啟動藥用蛋白基因，構(gòu)建了攜帶銀耳gpd啟動子及人胰島素基因的銀耳表達(dá)載體pCB-TBCA400，利用電激介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，把攜