雞NOD1基因克隆、功能及信號通路的初步研究.pdf

1、NOD-樣受體(NOD-like receptors，NLR)是胞質(zhì)型模式識別受體(PRR)，它同TLR、RLR等一樣，可以通過識別病原相關(guān)分子模式（PAMP）而迅速啟動先天性免疫反應(yīng)，并能通過NF-κB和MAPK等信號傳導(dǎo)途徑啟動適應(yīng)性免疫反應(yīng)，在機體的免疫防御過程中發(fā)揮著重要作用。NOD1是NLR家族中最具代表性的一個成員，在先天性免疫中參與炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡過程，也與一些炎癥性疾病的發(fā)生有關(guān)。研究報道，NLR家族在人有23個成員，

2、在鼠至少有34個成員，但在禽類的研究報道很少，未見具體有多少成員的明確報道。目前，對于禽類的NOD1的研究尚處于起步階段，而雞是一種重要的模式動物，同時也是重要的經(jīng)濟動物，因此，本研究以雞為研究對象，克隆雞NOD1基因的全長cDNA序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析;探查雞NOD1信號通路中NOD1、RIPK2、NF-κB和MAPK11基因在組織中的表達(dá)情況;通過NOD1的特異性配體iE-DAP刺激HD11細(xì)胞實驗和RNA干擾實驗，探討雞NOD

3、1基因?qū)ο掠涡盘柗肿蛹凹?xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用;通過體內(nèi)和體外沙門氏菌感染實驗，探討雞NOD1信號通路在抗沙門氏菌感染過程中的作用。
　　1.雞NOD1基因全長cDNA克隆及生物信息學(xué)分析
　　本研究通過反轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse transcription PCR)方法，3'和5'末端延伸技術(shù)（rapid-amplification of cDNA ends，RACE）擴增并獲得雞NOD1基因的全長cDNA序列。該基因全長cD

4、NA為4502bp，包含124bp的5'UTR，2856bp的開放閱讀框(ORE)和1497bp的3'UTR，后接22bp的polyA尾巴。ORF finder分析表明，雞NOD1基因的開放閱讀框位于125～2980區(qū)域，編碼一條含有951個氨基酸的蛋白質(zhì)。采用ProtParam在線軟件進(jìn)行理化性質(zhì)分析，該蛋白質(zhì)分子量為108676.2Mr，理論等電點(PI)為6.58，總原子數(shù)為15308，分子式為:C4885H7669N1285O1

5、421S48，不穩(wěn)定系數(shù)為36.77，總平均親水性為-0.160。經(jīng)預(yù)測，雞NOD1蛋白無信號肽和跨膜區(qū)。通過NCBI在線BLSTn，將序列直接與雞基因組進(jìn)行比對，該序列位于雞的2號染色體41824884-41845174位置，基因全長20290bp。預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)域的結(jié)果表明，雞NOD1蛋白由三個結(jié)構(gòu)域組成，分別為N端的CARD、中間的NACHT以及C端的LRR結(jié)構(gòu)域，經(jīng)比較，與鴨、火雞、人、小鼠、魚的NOD1蛋白結(jié)構(gòu)域一致。利用Clu

6、stalW軟件進(jìn)行多序列比對，并用MEGA軟件基于Poisson Correction模型構(gòu)建了進(jìn)化樹，表明雞NOD1蛋白與火雞親緣關(guān)系最近，與哺乳類動物的親緣關(guān)系近于與魚類動物的。
　　2.Real-time PCR檢測雞NOD1信號通路相關(guān)分子方法的建立及應(yīng)用
　　根據(jù)GenBank上公布的雞NOD樣受體NOD1、信號傳導(dǎo)分子RIPK2、TRAF6、CARD9、NF-κB(p65)、MAPK11和細(xì)胞因子IL-1β、IL

7、-8的mRNA序列，以β-actin為內(nèi)參基因，設(shè)計并合成8個目的基因及1個內(nèi)參基因的PCR擴增引物，建立檢測雞NOD1、RIPK2、TRAF6、CARD9、NF-κB(p65)、MAPK11和細(xì)胞因子IL-1β、IL-8 mRNA表達(dá)水平的相對熒光定量PCR方法。試驗結(jié)果顯示，9個基因的熒光定量PCR方法溶解曲線均呈單峰，溶解溫度在81.5℃～89.0℃之間，RT-PCR擴增效率為96.3％～102.3％，相關(guān)系數(shù)為0.966～0.9

8、96，斜率為-3.269～-3.413; Ct值的變異系數(shù)在1.85％～3.84％之間。表明，所建立的檢測8個目標(biāo)基因和1個內(nèi)參基因mRNA表達(dá)水平的熒光定量PCR方法特異性強、重復(fù)性高，完全滿足實驗要求，為后續(xù)試驗研究提供技術(shù)支持。
　　3.雞不同組織中NOD1、RIPK2、NF-κB和MAPK11的表達(dá)譜分析
　　NOD1是NLR受體中的一個重要成員，RIPK2是其接頭分子，RIPK2的活化可以引起下游NF-κB和MAP

9、K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活，因此，研究雞的不同組織器官中NOD1及其相應(yīng)接頭蛋白RIPK2及信號傳遞分子NF-κB和MAPK11的表達(dá)水平，有助于理解和分析機體對病原的先天性免疫應(yīng)答過程。為確定NOD1、RIPK2、NF-κB和MAPK11 mRNA在雞體內(nèi)組織中的表達(dá)情況，本研究對1日齡雛雞心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺、法氏囊、小腸（十二指腸）、腦、睪丸、卵巢、直腸和血液共13種組織中該四個基因mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NOD1

10、、RIPK2、NF-κB和MAPK11在檢測的13種組織中均有表達(dá)，但同一基因在不同組織中的表達(dá)量差異較大。其中，NOD1和NF-κB在血液中表達(dá)最高，RIPK2、MAPK11在腦組織中表達(dá)量最高。說明，NOD1、RIPK2、NF-κB和MAPK11在雞體的各組織中廣泛表達(dá)。
　　4.雞NOD1基因?qū)ο掠涡盘柗肿拥恼{(diào)節(jié)作用研究
　　為了探討雞NOD1基因?qū)ο掠涡盘柾废嚓P(guān)分子的調(diào)節(jié)作用，本研究通過RNAi抑制和外源性iE-D

11、AP誘導(dǎo)NOD1的表達(dá)后，檢測了RIPK2、NF-κB、TRAF6、CARD9、MAPK11、IL-1β和IL-8等基因的表達(dá)變化，以探討NOD1在HD11細(xì)胞中對這些基因的調(diào)節(jié)作用。本研究構(gòu)建了三個表達(dá)質(zhì)粒和一個陰性對照質(zhì)粒，即PLL3.7-NOD1-shRNA1、PLL3.7-NOD1-shRNA2、PLL3.7-NOD1-shRNA3和PLL3.7-NOD1-control shRNA。三個表達(dá)質(zhì)粒在HD11細(xì)胞中的抑制效率結(jié)果表

12、明，與PLL3.7-NOD1-control shRNA相比，PLL3.7-NOD1-shRNA1、PLL3.7-NOD1-shRNA2和PLL3.7-NOD1-shRNA3抑制效率在48h時分別為34.1％、19.3％和81.4％，在72h時分別為37.9％、58.1％和69.1％。檢測了轉(zhuǎn)染PLL3.7-NOD1-shRNA3表達(dá)載體和iE-DAP處理的HD11細(xì)胞中的RIPK2、NF-κB(p65)、TRAF6、CARD9、MAP

13、K11、IL-1β和IL-8的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在PLL3.7-NOD1-shRNA3抑制和iE-DAP激活HD11細(xì)胞中NOD1的表達(dá)水平后，除IL-1β外，信號傳導(dǎo)分子RIPK2、NF-κB(p65)、TRAF6、CARD9、MAPK11和細(xì)胞因子IL-8的表達(dá)水平也出現(xiàn)了相應(yīng)的下調(diào)和上調(diào)。這些結(jié)果提示，雞NOD1基因?qū)ζ湫盘柾废掠涡盘栟D(zhuǎn)導(dǎo)分子RIPK2、NF-κB(p65)、TRAF6、CARD9、MAPK11及細(xì)胞因子IL-

14、8的表達(dá)具有正向調(diào)節(jié)作用。
　　5.雞NOD1信號通路對沙門氏菌的識別作用
　　已有研究表明沙門氏菌可以激活NOD1信號通路，NOD1蛋白通過與下游的受體作用蛋白-2(RIPK2)分子相互作用，激活NF-κB、MAPK信號通路。然而，在禽類，沙門氏菌感染是否可以激活NOD1信號通路尚不清楚，因此，為了研究雞NOD1信號通路相關(guān)基因在沙門氏菌感染過程中的作用，本研究通過在體實驗，選擇10日齡AA肉雞，經(jīng)皮下每只注射0.2ml濃

15、度為1×108 cfu/mL的雞白痢沙門氏菌和腸炎沙門氏菌菌液，同時設(shè)立對照組。檢測沙門氏菌感染后的1d、3d、5d和7d脾臟和血液中NOD1、RIPK2、NF-κB、MAPK11、IL-1β和IL-8表達(dá)量變化。結(jié)果顯示，雞白痢沙門氏菌和腸炎沙門氏菌感染后，NOD1、RIPK2、NF-κB、MAPK11、IL-1β和IL-8的表達(dá)量在感染后的1-7d呈波動變化，表達(dá)量高峰是在感染后的3d、5d或7d。在HD11細(xì)胞中，用雞白痢沙門氏菌

16、感染細(xì)胞，檢測NOD1信號通路相關(guān)基因表達(dá)，結(jié)果表明，NOD1基因的表達(dá)量在雞白痢沙門氏菌感染的3.5h和6h顯著降低，1h、24h顯著增加;RIPK2在雞白痢沙門氏菌感染后6h，NF-κB在雞白痢沙門氏菌感染后1h表達(dá)量顯著下降，3.5h、6h和24h顯著增加;MAPK11的表達(dá)量在雞白痢沙門氏菌感染后的1h、6h略有下降但差異不顯著，24h時表達(dá)量顯著增加。細(xì)胞因子IL-1β和IL-8的表達(dá)量在雞白痢沙門氏菌感染后的1h、3.5h、