AAV9-shRNA-ADRB1-ZsGreen轉(zhuǎn)染SHR心肌下調(diào)β1-AR表達(dá)對(duì)美托洛爾降壓療效的影響.pdf

1、目的：
　　探討SHR心肌β1-AR表達(dá)下調(diào)對(duì)美托洛爾降壓效應(yīng)的影響。
　　方法：
　　1.病毒載體包裝及鑒定實(shí)驗(yàn):對(duì)本課題組前期成功構(gòu)建及篩選出的pAAV-ZsGreen-ADRB1-shRNA重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切及測(cè)序鑒定，采用三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法進(jìn)行AAV9-shRNA-ADRB1-ZsGreen重組腺相關(guān)病毒的包裝，并進(jìn)行病毒純化、滴度測(cè)定及體外感染293細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)。
　　2.SHR心肌轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn):將36只SHR隨

2、機(jī)分為3組:AAV9-shRNA-ADRB1-ZsGreen注射組、AAV9-CMV-ADRB1-ZsGreen注射組（陰性對(duì)照組）、假手術(shù)，每組12只。病毒載體采用心包腔注射法轉(zhuǎn)染SHR心肌，4周后處死大鼠，取心肌組織。采用Real-time RT-PCR法檢測(cè)各組SHR心肌組織中β1-AR基因mRNA表達(dá);采用免疫組化、Western-blot法檢測(cè)β1-AR蛋白的表達(dá)。
　　3.美托洛爾干預(yù)實(shí)驗(yàn):上述3組SHR每組同時(shí)隨機(jī)分

3、為兩個(gè)亞組，每組6只，分別給予美托洛爾和生理鹽水灌胃。每周監(jiān)測(cè)SHR血壓水平變化，連續(xù)干預(yù)4周后比較各組SHR血壓變化情況。
　　結(jié)果：
　　1.病毒載體包裝及鑒定:(1)酶切及測(cè)序鑒定結(jié)果表明前期構(gòu)建的pAAV-ZsGreen-ADRB1-shRNA重組質(zhì)粒為正確克隆;(2)病毒滴度測(cè)定結(jié)果表明純化后的AAV9-shRNA-ADRB1-ZsGreen滴度達(dá)1.5×1012vg/mL;(3)病毒載體感染293細(xì)胞效率可達(dá)95

4、％以上。
　　2.SHR心肌轉(zhuǎn)染的效應(yīng):(1) Real-time RT-PCR結(jié)果顯示，AAV9-shRNA-ADRB1-ZsGreen注射后β1-AR mRNA表達(dá)明顯低于陰性對(duì)照組(0.4142±0.3399 vs.1.0933±0.5853，P＜0.05);(2)免疫組化結(jié)果顯示，AAV9-shRNA-ADRB1-ZsGreen注射后β1-AR蛋白表達(dá)明顯低于陰性對(duì)照組及假手術(shù)組（50.02±4.44 vs.80.05±3

5、.72 vs.79.30±2.79，P＜0.05）;(3)Western blot結(jié)果顯示，AAV9-shRNA-ADRB1-ZsGreen注射后β1-AR蛋白表達(dá)明顯低于陰性對(duì)照組(0.5156±0.1199 vs.0.8333±0.1728, P＜0.05)。
　　3.SHR心肌β1-AR表達(dá)下調(diào)對(duì)血壓及美托洛爾療效的影響:干預(yù)4周后，(1) AAV9-shRNA-ADRB1-ZsGreen+美托洛爾組、陰性對(duì)照+美托洛爾組、

6、假手術(shù)+美托洛爾組收縮壓明顯低于陰性對(duì)照+生理鹽水組、假手術(shù)+生理鹽水組（174.8±3.9mmHg vs.168.3±5.3mmHg vs.167.2±5.1mmHg vs.199.4±3.1mmHg vs.198.3±4.5mmHg,P＜0.05）;(2) AAV9-shRNA-ADRB1-ZsGreen+生理鹽水組收縮壓明顯低于假手術(shù)+生理鹽水組（178.1±6.3mmHg vs.198.3±4.5mmHg，P＜0.05）;(3)

7、 AAV9-shRNA-ADRB1-ZsGreen+美托洛爾組收縮壓降低幅度明顯低于陰性對(duì)照組+美托洛爾組和假手術(shù)+美托洛爾組(22.84±1.72mmHg vs.28.78±2.72mmHg vs.30.16±5.71mmHg, P＜0.05);(4)AAV9-shRNA-ADRB1-ZsGreen+美托洛爾組與AAV9-shRNA-ADRB1-ZsGreen+生理鹽水組降壓幅度比較無(wú)顯著性差異(22.84±1.72mmHgvs.18