PLCε1基因在食管癌發(fā)生、進展中的作用及機制研究.pdf

1、食管癌是常見的惡性腫瘤之一。中國是食管癌的高發(fā)國家，食管癌在腫瘤的死亡率中排名第四。河北省磁縣是食管癌高發(fā)區(qū)，食管癌的發(fā)病率和死亡率均排名在所有腫瘤的首位，嚴重威脅著人們的健康。
　　食管癌的發(fā)生是環(huán)境因素和遺傳因素長期相互作用的結(jié)果。在河北省磁縣，食管癌的發(fā)生存在家族聚集現(xiàn)象提示遺傳背景在食管癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。我們前期對候選基因的研究已經(jīng)識別了一些與磁縣人群食管癌遺傳易感性相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點(single nucle

2、otidepolymorphism，SNP)。但是迄今為止，食管癌易感性的遺傳基礎(chǔ)仍不太明確。全基因組關(guān)聯(lián)研究采用高通量的基因分型技術(shù)，可以同時對成千上萬個SNP位點進行分析，而不需要預(yù)先選定候選基因，因此可能是沒有偏倚的研究。三個全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association study，GWAS)先后報道PLCε1基因rs2274223 A/G SNP與食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cel

3、l carcinoma，ESCC）的發(fā)病風險相關(guān)。隨后，這一結(jié)果在中國東部食管癌低發(fā)人群中得到證實。目前，這個SNP位點是否可以作為預(yù)測中國北方食管癌高發(fā)區(qū)人群ESCC發(fā)病風險的標志物尚未見報道。另外，rs11599672 T/G SNP位于PLCε1基因轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點，T→G的顛換可能導致PLCε1基因轉(zhuǎn)錄活性和表達水平的改變。研究表明，PLCε1基因rs11599672 T/G SNP可影響非西班牙白人吸煙、飲酒相關(guān)的非口咽部頭

4、頸鱗狀細胞癌遺傳易感性。Rs11599672 T/G SNP是否影響中國北方食管癌高發(fā)區(qū)人群ESCC的遺傳易感性尚未見報道。
　　PLCε1作為Ras原癌基因的效應(yīng)子，其在腫瘤發(fā)生和進展的作用已有較為廣泛的研究。PLCε1在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮促進或抑制作用。在化學致癌物誘導鼠皮膚腫瘤發(fā)生的過程中，PLCε1發(fā)揮促進作用。隨后的研究表明，PLCε1的促進作用可能歸因于其擴大了炎癥反應(yīng)。PLCε1通過增加炎癥反應(yīng)和血管形成促進鼠腸道腫瘤

5、的發(fā)生。但是，PLCε1在結(jié)直腸癌發(fā)生過程中可能發(fā)揮抑癌基因的作用。另外，PLCε1在腫瘤的進展過程中也有極其重要的作用。PLCε1被Rho激活后，刺激了IP3的產(chǎn)生、細胞內(nèi)Ca2+的流動、Ca2+/鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）上調(diào)，導致細胞骨架蛋白細絲蛋白的磷酸化。細絲蛋白的磷酸化降低了其與細絲狀肌動蛋白的相互作用，促進了頭頸鱗癌細胞的遷移。RNA干擾技術(shù)沉默PLCε1基因抑制了膀胱癌細胞的侵襲能力。由此可見，PLCε1在腫瘤

6、的發(fā)生和進展中均發(fā)揮重要的作用。
　　PLCε1在食管癌的發(fā)生、進展過程中發(fā)揮怎樣的作用？研究表明，食管癌組織較正常食管粘膜PLCε1的陽性表達率高;哈薩克族ESCC病人食管癌組織中PLCε1的表達水平高于其癌旁正常組織，而且PLCε1的表達增加與較晚的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。但是，PLCε1基因如何影響食管癌細胞的生物學行為及其可能的機制目前尚未見報道。
　　因此，本研究首先探討PLCε1基因rs2274223 A/G

7、SNP、rs11599672T/G SNP與中國北方高發(fā)區(qū)人群食管癌遺傳易感性的關(guān)系，旨在尋找能夠預(yù)測食管癌高風險個體的遺傳標志物，以真正實現(xiàn)食管癌的早診、早治，提高患者的生存率;為食管癌病因的遺傳學研究提供依據(jù)。
　　本研究亦擬通過RNA干擾技術(shù)沉默食管癌Eca109細胞PLCε1基因，觀察食管癌Eca109細胞生物學行為的變化，并測定增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的表達水平，明確PLCε1影響Eca109細胞生物學行為的機制。研

8、究將進一步確定PLCε1在食管癌進展中的作用及其機制，并為食管癌的基因治療提供實驗基礎(chǔ)。
　　第一部分、PLCε1基因多態(tài)性與食管鱗狀細胞癌遺傳易感性的關(guān)聯(lián)研究
　　目的:探討PLCε1基因rs2274223 A/G SNP和rs11599672 T/G SNP與河北省磁縣高發(fā)區(qū)人群食管癌遺傳易感性之間的關(guān)系。
　　方法:研究包括527例ESCC患者和527名健康對照個體。采集每位研究個體的靜脈抗凝血5ml，于4℃冰箱

9、保存。食管癌患者及健康對照個體的性別、年齡、吸煙習慣及上消化道腫瘤(upper gastrointestinalcancer，UGIC)家族史的情況均在采血后由專人詢問獲得。采血后1周內(nèi)應(yīng)用蛋白酶K消化-飽和氯化鈉鹽析法提取外周血白細胞DNA。采用聚合酶鏈反應(yīng)-連接酶檢測反應(yīng)(polymerase chain reaction-ligasedetection reaction，PCR-LDR)方法對PLCε1基因rs2274223 A/

10、G SNP和rs11599672 T/G SNP進行基因分型，分析這兩個SNP與磁縣人群食管癌遺傳易感性之間的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　1.ESCC患者組UGIC家族史陽性個體比例為48.6％，顯著高于健康對照組(39.3％)（x2=9.25，P=0.002），表明UGIC家族史可顯著增加ESCC的發(fā)病風險，經(jīng)性別、年齡、吸煙狀況校正后的OR值為1.47(95％CI=1.15～1.87)。
　　2.PLCε1基因rs22

11、74223 A/G SNP基因型分布在健康對照組中符合Hardy-Weinberg平衡(x2=0.21，P=0.65)。ESCC患者組及健康對照組的AA、AG、GG基因型頻率分別為48.0％、43.9％、8.1％和57.1％、37.5％、5.4％。與AA基因型相比，攜帶AG、GG、AG/GG基因型可能增加ESCC的發(fā)病風險，經(jīng)性別、年齡、吸煙狀況、UGIC家族史校正后的OR值分別為1.41(95％CI=1.09～1.83)、1.71(9

12、5％CI=1.03～2.86)、1.45(95％CI=1.13～1.85)。與攜帶AA基因型的UGIC家族史陰性個體相比，攜帶AG/GG基因型的家族史陰性個體、攜帶AG/GG基因型的家族史陽性個體ESCC發(fā)病風險增加(OR=1.41和2.10，95％CI=1.02～1.97和1.46～3.01)。
　　3.PLCε1基因rs11599672 T/G SNP基因型分布在健康對照組中符合Hardy-Weinberg平衡(x2=0.46

13、，P=0.50)。PLCε1基因rs11599672 T/G SNP等位基因頻率和基因型頻率總體分布在ESCC患者組及健康對照組之間無顯著性差異(P＞0.05)。與攜帶TT基因型的UGIC家族史陰性個體相比，攜帶TT基因型的家族史陽性個體ESCC發(fā)病風險增加(OR=1.59，95％CI=1.13～2.24)。
　　4.應(yīng)用2LD軟件對PLCε1基因的rs2274223A/GSNP和rs11599672T/G SNP進行聯(lián)合分析顯示

14、，兩個多態(tài)性位點間不存在連鎖不平衡現(xiàn)象(D'=0.11)。人群中最常見的單體型為AT，其在健康對照組中的頻率為55.2％，其他單體型頻率分別為AG(20.7％)、GT(17.5％)、GG(6.6％)。GT單體型增加了ESCC的發(fā)病風險(OR=1.36，95％CI=1.08～1.71)。
　　結(jié)論:
　　1.UGIC家族史可增加河北省磁縣高發(fā)區(qū)人群ESCC的發(fā)病風險，遺傳背景在食管癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。
　　2.本研究

15、首次報道了PLCε1基因rs2274223A/G SNP可以作為高發(fā)區(qū)人群ESCC遺傳易感性的標志物。UGIC家族史陽性個體、攜帶PLCε1基因rs2274223 A/G SNP AG、GG基因型的個體、尤其是攜帶AG/GG基因型且UGIC家族史陽性個體罹患ESCC的風險較高，應(yīng)定期接受食管內(nèi)鏡檢查，以便真正實現(xiàn)ESCC的早期診斷、早期治療。
　　3.PLCε1基因rs11599672 T/G SNP與河北省磁縣高發(fā)區(qū)人群ESCC

16、的發(fā)病風險無關(guān)。UGIC家族史與rs11599672T/G SNP聯(lián)合分析表明，UGIC家族史增加TT基因型攜帶者ESCC的發(fā)病風險。
　　4.與最常見的AT單體型相比，GT單體型增加了ESCC的發(fā)病風險。
　　第二部分 shRNA干擾沉默PLCε1基因?qū)κ彻馨〦ca109細胞增殖的影響及其機制的研究目的:探討沉默PLCε1基因?qū)κ彻馨〦ca109細胞增殖的影響及其可能的機制。
　　方法:根據(jù)shRNA設(shè)計原則，針對P

17、LCε1基因不同靶點構(gòu)建3個能夠編碼shRNA的質(zhì)粒表達載體(PLCε11、PLCε12、PLCε13)，用于沉默PLCε1基因;同時構(gòu)建1個通用陰性對照質(zhì)粒表達載體(HK)作為對照。采用陽離子脂質(zhì)體方法進行轉(zhuǎn)染。首先以PLCε11為例摸索轉(zhuǎn)染條件，確定轉(zhuǎn)染效率，然后篩選出干擾效果最好的質(zhì)粒表達載體(PLCε12)。RT-PCR和Western blot方法分別檢測PLCε12質(zhì)粒表達載體轉(zhuǎn)染24h、48h、72h后Eca109細胞PL

18、Cε1基因mRNA和蛋白表達水平，確定PLCε12質(zhì)粒表達載體RNA干擾的時間規(guī)律。MTT方法檢測PLCε12質(zhì)粒表達載體轉(zhuǎn)染48h、72h、96h后Eca109細胞的存活率。FCM檢測PLCε12質(zhì)粒表達載體轉(zhuǎn)染24h后Eca109細胞的細胞周期分布情況。RT-PCR方法檢測Eca109細胞p16、CyclinD1的mRNA表達。分析沉默PLCε1基因?qū)κ彻馨〦ca109細胞增殖的影響及其可能的機制。
　　結(jié)果:
　　1.

19、質(zhì)粒表達載體與陽離子脂質(zhì)體按照2μg∶6μl比例進行轉(zhuǎn)染時，轉(zhuǎn)染效率最高，平均為72.6％。PLCε12質(zhì)粒表達載體對PLCε1基因的干擾效果最好。PLCε12質(zhì)粒表達載體轉(zhuǎn)染Eca109細胞后，PLCε1 mRNA表達水平于轉(zhuǎn)染后24h開始下降，48h表達水平明顯降低，72h恢復(fù)至轉(zhuǎn)染前水平。PLCε1蛋白表達水平的變化與mRNA的表達變化規(guī)律一致。
　　2.MTT結(jié)果顯示:HK、PLCε12質(zhì)粒表達載體轉(zhuǎn)染Eca109細胞后4

20、8h、72h，PLCε12組Eca109細胞的存活率分別為80.73％和75.88％，顯著低于HK組Eca109細胞的存活率，兩者相比有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);轉(zhuǎn)染后96h，HK組與PLCε12組Eca109細胞的存活率無顯著差異(P＞0.05)。
　　3.Eca109細胞轉(zhuǎn)染后24h，Eca109組、HK組、PLCε12組處于S期的Eca109細胞分別占19.53％、17.20％和4.80％。Eca109組和HK組處于S期的

21、Eca109細胞比例無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);PLCε12組處于S期的Eca109細胞比例明顯低于HK組(P＜0.05)，細胞周期阻滯于G0/G1期。
　　4.PLCε12質(zhì)粒表達載體轉(zhuǎn)染Eca109細胞48h后，HK組與PLCε12組Eca109細胞p16的相對光密度值分別為0.38和0.58，PLCε12組Eca109細胞p16 mRNA表達水平明顯高于HK組Eca109細胞(P＜0.05);HK組與PLCε12組Eca1

22、09細胞CyclinD1 mRNA表達水平無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論:沉默PLCε1基因?qū)ca109細胞增殖具有抑制作用，細胞周期阻滯于G0/G1期。其可能的機制為:沉默PLCε1基因上調(diào)了p16基因的表達，p16蛋白抑制了CDK4的活性，抑制與CyclinD1結(jié)合的Rb的Ser和Tyr殘基磷酸化，抑制轉(zhuǎn)錄因子E2F的釋放，E2F依賴性基因轉(zhuǎn)錄表達受抑，阻止細胞從G1期向S期的過渡，因而抑制了Eca109細胞的增殖

23、活性。
　　第三部分、shRNA干擾沉默PLCε1基因?qū)κ彻馨〦ca109細胞凋亡、侵襲的影響及其機制的研究
　　目的:探討沉默PLCε1基因?qū)κ彻馨〦ca109細胞凋亡、侵襲的影響及其可能的機制。
　　方法:FCM檢測PLCε12質(zhì)粒表達載體轉(zhuǎn)染48h后Eca109細胞的凋亡情況。Transwell小室侵襲實驗檢測PLCε12質(zhì)粒表達載體轉(zhuǎn)染48h后Eca109細胞的侵襲能力。RT-PCR方法檢測Eca109細胞Fa

24、s、FasL、CD44、MMP9、VEGF的mRNA表達。分析沉默PLCε1基因?qū)κ彻馨〦ca109細胞凋亡、侵襲的影響及其可能的機制。
　　結(jié)果:
　　1.Eca109細胞轉(zhuǎn)染后48h，Eca109組、HK組和PLCε12組Eca109細胞的凋亡率分別為26.22％、22.06％和30.27％。Eca109組和HK組Eca109細胞的凋亡率無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);但是PLCε12組Eca109細胞的凋亡率明顯高于HK

25、組Eca109細胞(P＜0.05)。
　　2.HK、PLCε12質(zhì)粒表達載體轉(zhuǎn)染Eca109細胞后48h，HK組與PLCε12組Eca109細胞Fas的相對光密度值分別為0.43和0.53; FasL的相對光密度值分別為0.42和0.33。兩組Eca109細胞Fas、FasL的mRNA表達水平存在統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。
　　3.Eca109細胞轉(zhuǎn)染后48h，Eca109組、HK組和PLCε12組穿過Transwell小

26、室聚碳酸酯膜的Eca109細胞數(shù)分別為85.00、82.00和62.67。Eca109組和HK組穿過Transwell小室膜的Eca109細胞數(shù)無統(tǒng)計學差異(P＞0.05); PLCε12組穿過Transwell小室膜的Eca109細胞數(shù)明顯低于HK組(P＜0.05)。
　　4.HK、PLCε12質(zhì)粒表達載體轉(zhuǎn)染Eca109細胞后48h，HK組與PLCε12組Eca109細胞MMP9的相對光密度值分別為0.60和0.53; VEG

27、F的相對光密度值分別為0.28和0.17。兩組Eca109細胞MMP9、VEGF的mRNA表達水平存在統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。HK組與PLCε12組Eca109細胞CD44的mRNA表達水平無顯著差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.PLCε1基因的沉默促進Eca109細胞的凋亡，可能是通過上調(diào)Fas的表達、下調(diào)FasL的表達，抑制了免疫逃逸和免疫反攻，使得Eca109細胞凋亡增加。
　　2.PLCε1基因的