杜仲葉黃酮苷元制備、與蛋白相互作用及免疫活性研究.pdf

1、我國杜仲資源非常豐富，而杜仲葉中富含黃酮類、環(huán)烯醚萜類、木脂素類和苯丙素類等活性化合物。近年研究表明，黃酮苷元的效價(jià)比黃酮苷要高，因此杜仲黃酮苷元具有極高的開發(fā)和利用價(jià)值。本文以杜仲葉為原料，在建立快速檢測杜仲黃酮苷元方法的基礎(chǔ)上；優(yōu)化了杜仲黃酮苷元的制備工藝；考察了杜仲中常見的五種黃酮類化合物與牛血清白蛋白的作用機(jī)理，并初步探討不同純度杜仲黃酮的免疫活性。相關(guān)研究內(nèi)容如下：
　?。?）建立了杜仲黃酮苷元的快速檢測方法，并對水解前

2、后杜仲葉和杜仲素中黃酮苷元含量進(jìn)行了測定。通過優(yōu)化，得到同時(shí)測定杜仲黃酮苷元的高效液相色譜條件為：色譜柱：Diamonsil C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.2％磷酸水溶液（63∶37）；檢測波長：370nm；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL；槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線為 Y=41375X-76112，R=0.9997，檢測范圍為0.5~80μg/mL；山奈酚標(biāo)準(zhǔn)曲線為 Y=9694.9X-676

3、84，R=0.9996，檢測范圍為0.5~18μg/mL。方法學(xué)考察結(jié)果表明，該法精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及加標(biāo)回收率良好。樣品檢測結(jié)果顯示，杜仲葉中槲皮素含量為0.021%，山奈酚含量是0.005%；通過酸水解，杜仲葉黃酮苷元含量提高20倍，杜仲素提高約7倍。
　?。?）優(yōu)化了制備杜仲黃酮苷元的水解工藝，并對苷元的富集工藝進(jìn)行了研究。采用濃度6 mol/L的鹽酸進(jìn)行水解，料液比為2∶1（mg/mL），水解溫度80℃，水解時(shí)間3 h

4、。該條件下，所得黃酮苷元的含量可達(dá)2.512%。將水解樣品采用聚酰胺兩步法富集杜仲黃酮苷元，即減壓濃縮、脫酸處理后，經(jīng)聚酰胺一步富集，黃酮苷元含量達(dá)到12.87%，再干法上樣，經(jīng)聚酰胺兩步富集后，杜仲黃酮苷元含量可達(dá)63.19%。進(jìn)一步柱層析純化，得到純度為85.27%的槲皮素。
　?。?）在模擬人體生理?xiàng)l件下，采用簡便易行的光譜學(xué)手段，系統(tǒng)的研究了在杜仲中五種常見的黃酮類化合物與牛血清白蛋白的相互作用，并考察了金屬離子Cu2+、

5、Zn2+、Pb2+、Fe3+和Mn2+對體系產(chǎn)生的影響。結(jié)果表明，黃酮類物質(zhì)對牛血清白蛋白的猝滅均屬于靜態(tài)猝滅。結(jié)合常數(shù)的大小依次為山奈酚>槲皮素>蘆丁>槲皮苷>紫云英苷，并且均能夠形成一個(gè)高親結(jié)合位點(diǎn)。熱力學(xué)參數(shù)表明，各體系的結(jié)合過程中主要作用力類型為疏水作用力、范德華力和氫鍵?！鱃<0表明各體系均屬于自發(fā)反應(yīng)。根據(jù) Frest能量轉(zhuǎn)移理論，這五種黃酮類小分子與牛血清白蛋白之間發(fā)生非輻射能量傳遞；結(jié)合距離的大小為蘆丁>槲皮苷>紫云英苷

6、>山奈酚>槲皮素。紫外-可見吸收光譜、同步熒光光譜及三維熒光光譜等結(jié)果表明這些猝滅劑與牛血清白蛋白相互作用時(shí)，會導(dǎo)致肽鏈結(jié)構(gòu)和氨基酸殘基附近的微環(huán)境會發(fā)生相應(yīng)的變化。金屬離子的存在不會改變猝滅類型、結(jié)合位點(diǎn)，但是對結(jié)合常數(shù)、結(jié)合距離及作用力類型會產(chǎn)生不同程度的影響。
　　（4）利用 MTT法和酶聯(lián)免疫吸附法，通過考察不同純度的杜仲黃酮對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ誘生作用的影響，初步探討杜仲黃酮的免疫活性。結(jié)果