Bt cry1Ia8-cry1C基因轉(zhuǎn)化甘藍(lán)及高代轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)的抗蟲性研究.pdf

1、結(jié)球甘藍(lán)（Brassica oleracea L. var. capitata）是我國一種重要的蔬菜。目前，生產(chǎn)上為害甘藍(lán)生長的主要是菜青蟲、小菜蛾、甘藍(lán)夜蛾和甜菜夜蛾等鱗翅目害蟲。甘藍(lán)類蔬菜中抗蟲種質(zhì)資源缺乏，因此利用傳統(tǒng)育種方法培育抗蟲品種比較困難。通過基因工程將外源抗蟲基因整合到植物基因組中，可為甘藍(lán)抗蟲育種提供有效的種質(zhì)資源。
　　cry1Ia8基因是由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所分離克隆獲得的，其編碼的毒蛋白對(duì)小菜蛾等鱗

2、翅目害蟲具有高毒力，與生產(chǎn)上常用的Cry1Ac抗蟲蛋白沒有交互抗性。cry1C基因是經(jīng)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所進(jìn)行密碼子優(yōu)化后由本課題組人工合成的基因，對(duì)鱗翅目夜蛾類害蟲有顯著的抗蟲效果。本研究構(gòu)建了cry1Ia8-cry1C雙價(jià)表達(dá)載體，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將雙價(jià)基因?qū)虢Y(jié)球甘藍(lán)，以期獲得兩種毒蛋白同時(shí)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株，既可有效抑制小菜蛾、菜青蟲等害蟲，又可降低夜蛾類害蟲對(duì)甘藍(lán)的危害。同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)cry1Ia8基因甘藍(lán)和轉(zhuǎn)cry1Ia

3、8-cry1Ba3基因甘藍(lán)后代的農(nóng)藝性狀、抗蟲性及對(duì)意大利蜜蜂的影響進(jìn)行了調(diào)查。主要研究結(jié)果如下：
　　1.構(gòu)建cry1Ia8-cry1C雙價(jià)表達(dá)載體，通過PCR檢測和序列測定，證明外源基因cry1Ia8和cry1C已經(jīng)整合到同一植物表達(dá)載體上。
　　2.對(duì)以F13J85為轉(zhuǎn)化受體的甘藍(lán)再生體系和轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了優(yōu)化，以下胚軸和具柄子葉為外植體，苗齡5 d，平放培養(yǎng)基上接種時(shí)，外植體不定芽再生率最高；農(nóng)桿菌侵染時(shí)將OD600為

4、0.6-0.8的菌液稀釋至0.1-0.2，侵染12-15 min，轉(zhuǎn)化效率最高，后期農(nóng)桿菌污染較少。將cry1Ia8-cry1C雙價(jià)基因?qū)敫仕{(lán)獲得16株卡那霉素抗性植株，對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行PCR檢測，有12株擴(kuò)增出目的片段；southern檢測，有8株陽性植株；RT-PCR和Western blot檢測，均有7株陽性植株。
　　3.2014年秋，調(diào)查田間轉(zhuǎn)cry1Ia8基因甘藍(lán)和轉(zhuǎn)cry1Ia8-cry1Ba3基因甘藍(lán)T4代純系的農(nóng)

5、藝性狀及害蟲種類和數(shù)量，轉(zhuǎn)基因植株在株高、開展度、單球重、球徑、中心柱、最大葉外長和外葉數(shù)等主要農(nóng)藝性狀方面，與對(duì)照相比均沒有顯著差異。田間抗蟲性試驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)cry1Ia8基因甘藍(lán)和轉(zhuǎn)cry1Ia8-cry1Ba3基因甘藍(lán)T4代植株對(duì)菜青蟲和小菜蛾仍有顯著抗性，但對(duì)甘藍(lán)夜蛾和甜菜夜蛾的抗蟲效果不明顯。
　　4.以轉(zhuǎn)cry1Ia8基因甘藍(lán)花粉為材料，飼喂意大利蜜蜂，對(duì)其存活率和體重沒有顯著影響，雖然引起了蜜蜂體內(nèi)某些代謝解毒酶和蛋白