小續(xù)命湯對(duì)急性腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、本文從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 小續(xù)命湯對(duì)急性腦缺血再灌注損傷的總體作用及對(duì)血腦屏障的保護(hù)作用研究
　　目的:通過建立腦缺血再灌注損傷模型，探討小續(xù)命湯對(duì)急性腦缺血再灌注損傷的總體作用及對(duì)血腦屏障的保護(hù)作用。
　　方法:將120只SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠隨機(jī)分為5組，分別為假手術(shù)組(Sham)，腦缺血再灌注組(IR)，腦缺血再灌注+小續(xù)命湯低劑量組(15g/kg/day)(XXM

2、D15)，腦缺血再灌注+小續(xù)命湯中劑量組(30 g/kg/day)(XXMD30)，腦缺血再灌注+小續(xù)命湯高劑量組(60 g/kg/day)(XXMD60)。采用左側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)法建立局灶性腦缺血再灌注損傷模型。腦缺血再灌注24 h后進(jìn)行2，3，5-triphenyltetrazolium chloride(TTC)染色，根據(jù)TTC染色計(jì)算腦梗死面積及半球腫

3、脹;實(shí)驗(yàn)各組腦缺血病理性損害通過再灌注24h后hematoxylin-eosin(HE)染色進(jìn)行評(píng)估;于不同時(shí)間點(diǎn)觀察各組大鼠的行為學(xué)改變;再灌注24 h后透射電鏡觀察血腦屏障亞顯微結(jié)構(gòu)的變化。通過測(cè)定腦含水量、伊文思藍(lán)滲出量評(píng)估腦水腫形成及血腦屏障通透性改變。免疫組織化學(xué)染色、western blot檢測(cè)急性腦缺血再灌注后MMP-9，MMP-2及VEGF的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:與腦缺血再灌注模型組比較，小續(xù)命湯中、高劑量(30/

4、60 g/kg/day)治療可顯著縮小急性腦缺血再灌注導(dǎo)致的腦梗死面積和半球腫脹，明顯減輕缺血性病理改變，顯著改善模型動(dòng)物的行為學(xué)表現(xiàn)。小續(xù)命湯(60 g/kg/day)治療可明顯減少腦含水量、伊文思藍(lán)滲出量，保護(hù)血腦屏障的亞顯微結(jié)構(gòu)。另外我們還發(fā)現(xiàn)小續(xù)命湯(60 g/kg/day)治療可顯著下調(diào)腦缺血再灌注后MMP-9，MMP-2及VEGF的表達(dá)。
　　結(jié)論:小續(xù)命湯對(duì)急性腦缺血再灌注損傷有一定的神經(jīng)保護(hù)作用，60 g/kg/d

5、ay是小續(xù)命湯治療急性腦缺血再灌注損傷的最佳療效劑量。小續(xù)命湯(60 g/kg/day)可從結(jié)構(gòu)、功能上減輕腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致的血腦屏障破壞，可能與下調(diào)MMP-9，MMP-2及VEGF的表達(dá)有關(guān)。
　　第二部分 小續(xù)命湯對(duì)急性腦缺血再灌注神經(jīng)血管單元的保護(hù)作用及機(jī)制研究
　　目的:通過建立腦缺血再灌注損傷動(dòng)物模型，探討小續(xù)命湯對(duì)急性腦缺血再灌注神經(jīng)血管單元的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。
　　方法:將106只SPF級(jí)雄性SD大

6、鼠隨機(jī)分為5組，分別為假手術(shù)組(Sham)、腦缺血再灌注模型組(I/R、腦缺血再灌注+小續(xù)命湯治療組(60 g/kg/day)(XXMD60)，腦缺血再灌注+小續(xù)命湯治療+LY294002組(XXMD60+LY294002)，腦缺血再灌注+小續(xù)命湯治療+Vehicle組(XXMD60+Vehicle)。小續(xù)命湯治療組術(shù)前3d開始連續(xù)灌胃給予相應(yīng)體積的小續(xù)命湯至觀察時(shí)間節(jié)點(diǎn)。采用左側(cè)大腦中動(dòng)脈線栓法建立腦缺血再灌注損傷模型。XXMD60+

7、LY294002、XXMD60+Vehicle組在腦缺血誘導(dǎo)前30 min側(cè)腦室給予10μl10 mM LY294002或Vehicle。腦缺血90 min再灌注24h后進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，TTC染色評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)各組腦梗死面積。再灌注24 h后Nissl染色評(píng)估實(shí)驗(yàn)各組缺血皮層半暗帶區(qū)的完整細(xì)胞數(shù)。再灌注24 h后TUNEL染色聯(lián)合免疫熒光法標(biāo)記不同的細(xì)胞標(biāo)記物(NeuN、GFAP、CD31)以檢測(cè)實(shí)驗(yàn)各組缺血皮層半暗帶區(qū)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)

8、細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡情況。Westernblot檢測(cè)各組急性腦缺血再灌注后PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:與腦缺血再灌注模型組比較，小續(xù)命湯(60 g/kg/day)可顯著促進(jìn)急性腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)，減少腦梗死面積，促進(jìn)缺血半暗帶區(qū)細(xì)胞的存活，而PI3K抑制劑可阻斷小續(xù)命湯的保護(hù)作用。TUNEL及免疫熒光結(jié)果提示小續(xù)命湯可顯著減少神經(jīng)血管單元多種類型細(xì)胞凋亡，PI3K抑制劑可阻斷小續(xù)命湯的多靶點(diǎn)抗凋

9、亡作用。Western blot結(jié)果顯示小續(xù)命湯顯著上調(diào)p-PDK1(Ser241)，p-PTEN(Ser380)，p-Akt(Ser473)，p-GSK3β(Ser9)及p-c-Raf(Ser259)蛋白的表達(dá)，PI3K抑制劑與小續(xù)命湯聯(lián)用時(shí)可破壞小續(xù)命湯對(duì)p-PDK1(Ser241)，p-Akt(Ser473)，p-GSK3β(Ser9)蛋白表達(dá)的影響，而不能阻斷p-PTEN(Ser380)，p-c-Raf(Ser259)蛋白的表達(dá)

10、上調(diào)。
　　結(jié)論:小續(xù)命湯治療(60 g/kg/day)可抑制急性腦缺血再灌注導(dǎo)致的神經(jīng)血管單元多種類型細(xì)胞凋亡，該保護(hù)作用可能與激活的PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)。
　　第三部分 小續(xù)命湯對(duì)急性腦缺血再灌注線粒體的保護(hù)作用及機(jī)制研究
　　目的:本部分研究旨在通過建立腦缺血再灌注損傷動(dòng)物模型，探討小續(xù)命湯對(duì)急性腦缺血再灌注線粒體的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。
　　方法:將85只SPF級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sha

11、m)、腦缺血再灌注組(I/R)、腦缺血再灌注+小續(xù)命湯治療組(60g/kg/day)(XXMD60)，共三組。小續(xù)命湯治療組從術(shù)前3d開始連續(xù)灌胃給予相應(yīng)體積的小續(xù)命湯至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，而假手術(shù)組及腦缺血再灌注組給予相應(yīng)體積的雙蒸水。腦缺血再灌注損傷由左側(cè)大腦中動(dòng)脈線栓法誘導(dǎo)。腦缺血再灌注24 h后透射電鏡觀察急性腦缺血再灌注后實(shí)驗(yàn)各組線粒體的形態(tài)改變。再灌注24 h后TUNEL染色聯(lián)合cleaved caspase3免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)腦缺

12、血皮層半暗帶區(qū)的細(xì)胞凋亡。將新鮮腦組織分離提取線粒體蛋白、胞漿蛋白部分，首先進(jìn)行純化驗(yàn)證，免疫熒光染色聯(lián)合western blot觀察急性腦缺血再灌注后p53蛋白在線粒體的表達(dá)及p53蛋白的線粒體轉(zhuǎn)位，并用western blot檢測(cè)急性腦缺血再灌注后線粒體p53通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:小續(xù)命湯治療(60 g/kg/day)可明顯減輕急性腦缺血再灌注導(dǎo)致的線粒體形態(tài)改變。與模型組比較，小續(xù)命湯可顯著抑制缺血皮層半暗帶區(qū)神經(jīng)

13、細(xì)胞凋亡。另外，小續(xù)命湯可顯著下調(diào)p53蛋白在線粒體的表達(dá)，減少p53蛋白的線粒體轉(zhuǎn)位及線粒體Bax蛋白表達(dá)水平，上調(diào)線粒體部分Bcl-2蛋白的表達(dá)，減少cytochromec，Smac/Diablo蛋白從線粒體的釋放，抑制胞漿部分caspase9，caspase3的活化，并上調(diào)c-IAP1的表達(dá)。
　　結(jié)論:小續(xù)命湯治療(60g/kg/day)可明顯保護(hù)急性腦缺血再灌注后線粒體的形態(tài)，抑制細(xì)胞凋亡，減少線粒體p53表達(dá)和p53線