RNA干擾沉默視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤SO-RB-,50-細(xì)胞中survivin基因表達(dá)的研究.pdf

1、中山大學(xué)碩士學(xué)位論文RNA干擾沉默視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤SORB細(xì)胞中survivin基因表達(dá)的研究姓名：聶莉申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：眼科學(xué)指導(dǎo)教師：李永平20060501RNA干擾沉默視|刊膜母細(xì)胞癰SORB50細(xì)胞葉1survivin摧聞表達(dá)的研究聶莉顫十學(xué)位論文術(shù)，它通過將雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞，在Dicer酶的作用下裂解為19～29個(gè)核苷酸的小干擾RNA，特異性地降解相應(yīng)序列地mRNA，導(dǎo)致特定基因轉(zhuǎn)錄后沉默。目前RNA干擾已應(yīng)用于基因敲除

2、、基因表達(dá)調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因治療等方面的研究，與上述抑制基因表達(dá)的研究方法相比，RNA干擾能夠更加高效特異地進(jìn)行特定基因的抑制。目前國(guó)內(nèi)外相繼有學(xué)者應(yīng)用siRNA技術(shù)來抑制腫瘤細(xì)胞中survivin基因表達(dá)的報(bào)道，我們查閱了文獻(xiàn)但尚未見報(bào)道RNA干擾沉默視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中survivin基因表達(dá)的研究，故本實(shí)驗(yàn)合成了針對(duì)survJvYz#j￡因的RNA干擾雙鏈，觀察其沉默視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SORB。。中凋亡抑制因子survivin表達(dá)

3、的效果，并進(jìn)一步在細(xì)胞學(xué)水平上研究SUFV[vinX|J細(xì)胞增值和誘導(dǎo)凋亡方面的影響及其可能的作用機(jī)制。方法首先應(yīng)用細(xì)胞免疫組織化學(xué)的方法驗(yàn)證survivin在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤SO—l‰，細(xì)胞q1表達(dá)，然后根據(jù)人survivin基因的mRNA序列，設(shè)計(jì)針對(duì)survivin基因的siRNA序列和對(duì)survivin基因無抑制作用的陰性對(duì)照siRNA序列，利用體外化學(xué)合成法合成。為了防止綠色熒光FAM標(biāo)記后影響survivinsiRNA對(duì)靶基因

4、的沉默效果，故將FAM標(biāo)記在陰性對(duì)照siRNA的5’末端。首先將FAM標(biāo)記的陰性對(duì)照siRNA與轉(zhuǎn)染試劑以不同的比例轉(zhuǎn)入sO—RB；。細(xì)胞，分別在轉(zhuǎn)染24h、48h后在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)發(fā)綠色熒光的細(xì)胞占總的細(xì)胞的比例，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率，從而篩選出轉(zhuǎn)染的最佳比例和時(shí)間，然后再以最佳比例將survivinsiRNA轉(zhuǎn)XSORB。。細(xì)胞，并設(shè)平行對(duì)照組。轉(zhuǎn)染24h后通過半定量RT—PeR和WesternBlot檢測(cè)其對(duì)SO—R‰細(xì)胞中surviv